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    壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠CGRP及β2—AR的影響

    2018-05-23 11:50甘國(guó)興劉毓李勁平張國(guó)民易仲媛
    關(guān)鍵詞:壯骨骨組織骨細(xì)胞

    甘國(guó)興 劉毓 李勁平 張國(guó)民 易仲媛

    [摘要] 目的 探討壯骨止痛方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)及骨組織β2-AR表達(dá)的影響。 方法 72只SPF級(jí)雌性SD大鼠隨機(jī)選出12只,摘除卵巢周圍相應(yīng)質(zhì)量脂肪后作為假手術(shù)組。其余60只采用雙側(cè)去卵巢法制備骨質(zhì)疏松病理模型,隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方高劑量組(13.2 g/kg)、中劑量組(6.6 g/kg)、低劑量組(3.3 g/kg)和戊酸雌二醇組(2.1×10-5 g/kg),每組各12只。模型組及假手術(shù)組給予等體積純凈水,均干預(yù)13周。采用ELISA法檢測(cè)血清CGRP含量,免疫組化法檢測(cè)骨組織β2-AR蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清CGRP含量顯著減少,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。與模型組比較,戊酸雌二醇組及壯骨止痛方各劑量組大鼠血清CGRP含量顯著增加,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05或P < 0.01)。壯骨止痛方不同劑量組組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 結(jié)論 壯骨止痛方能夠促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP表達(dá),上調(diào)骨組織β2-AR蛋白表達(dá),這可能是其抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制之一。

    [關(guān)鍵詞] 骨質(zhì)疏松;壯骨止痛方;降鈣素基因相關(guān)肽;β2型腎上腺素能受體

    [中圖分類號(hào)] R259 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2018)03(a)-0009-04

    [Abstract] Objective To explore the effect of Zhuanggu Zhitong prescription on the CGRP and β2-AR in ovariectomized osteoporosis rats and investigate its mechanism in anti-osteoporosis. Method 72 rats were randomly divided into sham operation group (12 cases) and model group (60 cases), the model group rats were ovariectomized osteoporosis and the sham operation group rats were excised equal weight fat. After the modeling, the rats were randomly divided into model group, Zhuanggu Zhitong prescription high-dose group (13.2 g/kg), middle-dose group (6.6 g/kg), low-dose group (3.3 g/kg) and estradiol valerate group (2.1×10-5 g/kg), with 12 rats in each group. The model group and sham operation group rats were given equal volume water. All intervened for 13 weeks. The content of CGRP in serum was detected by ELISA and protein expression of β2-AR in bone tissue were detected by immunohistochemistry. Results Compared with sham operation group, the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of model group were significantly declined, with high statistically significant differences (all P < 0.01). Compared with the model group, the content of CGRP in serum and protein expression of β2-AR in bone tissue of different doses Zhuanggu Zhitong prescription group and estradiol valerate group were increased significantly, with statistically significant differences (P < 0.05 or P < 0.01). There were no significant differences in different doses of Zhuanggu Zhitong prescription groups (P > 0.05). Conclusion Zhuanggu Zhitong prescription can promote the secretion of CGRP and protein expression of β2-AR, which may be one mechanism of ZhuangguZhitong prescription to anti-osteoporosis.

    [Key words] Osteoporosis; Zhuanggu Zhitong prescription; CGRP; β2-AR

    壯骨止痛方對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有很好的療效[1]。骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)/核因子-κβ受體活化因子(receptor activator of nuclear factor kappa β,RANK)/核因子κβ受體活化因子配體(ligand of receptor activator of nuclear factor kappa β,RANKL)信號(hào)通路在骨代謝中具有重要作用,是影響破骨細(xì)胞生成和調(diào)節(jié)其功能最重要的途徑,通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡,可以影響信號(hào)通路下游因子進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的增值和凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn),壯骨止痛方能夠上調(diào)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清及骨組織OPG表達(dá),下調(diào)RANKL表達(dá),提高OPG/RANKL比值[3],但壯骨止痛方如何調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn),交感神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上的腎上腺素受體結(jié)合對(duì)骨量進(jìn)行調(diào)節(jié),腎上腺素能可以調(diào)節(jié)OPG和RANKL的表達(dá)[4]。降鈣素基因相關(guān)肽(calctionin gene-related peptide,CGRP)通過(guò)與其受體結(jié)合,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能,參與骨的生長(zhǎng)、修復(fù)和重建[5]。本文從調(diào)節(jié)CGRP和β2-AR的角度探討壯骨止痛方抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 一般資料

    1.1.1 動(dòng)物 200 g左右3月齡SPF級(jí)SD雌性大鼠72只,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)NO.43004700005517。標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔動(dòng)物房,室溫23~25℃,相對(duì)濕度50%~70%。

    1.1.2 藥物及試劑 壯骨止痛方(包括補(bǔ)骨脂、女貞子、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、枸杞子等7味中藥)藥材購(gòu)自長(zhǎng)沙九芝堂股份有限公司,由中南大學(xué)藥學(xué)院李勁平教授鑒定并制備。戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,生產(chǎn)批號(hào):J20130009),CGRP ELISA檢測(cè)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司),β2-AR免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

    1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(BioTek,USA),HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海南陽(yáng)儀器有限公司),LEICA DMLB2 型雙目顯微鏡(德國(guó)LEICA公司),MIAS型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北航公司),Shandon325型石蠟切片機(jī)(英國(guó)Shandon公司),DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),Motic B5型顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 造模及給藥 按照參考文獻(xiàn)[3]方法,按體重指數(shù)隨機(jī)選出12只大鼠,摘除卵巢周圍相應(yīng)質(zhì)量的脂肪作為假手術(shù)組,其余60只大鼠采用雙側(cè)去卵巢法制備骨質(zhì)疏松病理模型,按體重隨機(jī)分為模型組、壯骨止痛方高劑量組(13.2 g/kg)、中劑量組(6.6 g/kg)、低劑量組(3.3 g/kg)和戊酸雌二醇組(2.1×10-5 g/kg),每組各12只。分組后,除模型組及假手術(shù)組給予等體積純凈水外,其余各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物,均干預(yù)13周,劑量按人鼠體表面積換算。

    1.2.2 血清CGRP含量檢測(cè) 給藥干預(yù)結(jié)束后,大鼠用10%水合氯醛麻醉后采血,靜置2 h,3500 r/min離心15 min,取上清液采用ELISA法按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清CGRP含量。

    1.2.3 骨組織β2-AR蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[3]采用免疫組化法(SABC法)檢測(cè)骨組織β2-AR蛋白表達(dá)。以棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性,采用北航MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)符合正態(tài)性及方差齊性,采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差齊性,則用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 對(duì)大鼠血清CGRP和骨組織β2-AR的影響

    與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清CGRP含量顯著下降,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。與模型組比較,戊酸雌二醇組大鼠血清CGRP含量顯著增加,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01或P < 0.05)。壯骨止痛方干預(yù)后,與模型組比較,各劑量組大鼠血清CGRP含量均顯著增加,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01或P < 0.05);壯骨止痛方不同劑量組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表1,圖1(封三)。

    3 討論

    壯骨止痛方由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞子、川牛膝等7味藥物組成,既著重補(bǔ)腎氣、溫腎陽(yáng),兼顧滋補(bǔ)肝腎陰精,同時(shí)加用通經(jīng)化瘀活絡(luò)之品,具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋骨的作用,對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有確切療效[1]。壯骨止痛方能夠通過(guò)調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松模型大鼠OPG/RANKL平衡發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[4],但是具體作用環(huán)節(jié)尚未清楚。研究發(fā)現(xiàn)[4]交感神經(jīng)系統(tǒng)可能是通過(guò)激活成骨細(xì)胞上的β2-AR進(jìn)而激活破骨細(xì)胞分化因子RANKL來(lái)間接發(fā)揮對(duì)破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,CGRP能夠調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達(dá)量的相對(duì)比值發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。因此,研究壯骨止痛方對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP和β2-AR的影響,可以闡明其調(diào)節(jié)OPG/RANKL平衡的具體作用環(huán)節(jié)。

    CGRP通過(guò)與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上的受體結(jié)合,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能,參與調(diào)節(jié)骨的生長(zhǎng)、修復(fù)及改建[5]。梁偉[6]研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)濃度的降鈣素基因相關(guān)肽可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,且呈劑量依賴性。楊亞?wèn)|等[7]研究表明,CGRP能夠調(diào)節(jié)OPG、RANKL表達(dá)量的相對(duì)比值,間接地參與骨折愈合過(guò)程的調(diào)節(jié)。陳光華等[8]等研究發(fā)現(xiàn),CGRP能夠經(jīng)調(diào)節(jié)OPG/RANKL比值,進(jìn)而調(diào)控骨的吸收與形成。去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP含量明顯降低,骨組織CGRP及其受體蛋白表達(dá)下調(diào),藥物干預(yù)后血清及骨組織CGRP顯著增加,骨密度增加[9-10]。本研究中去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP蛋白表達(dá)下調(diào),結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

    越來(lái)越多的研究表明,交感神經(jīng)系統(tǒng)能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能,在骨量的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[11-14]。交感神經(jīng)系統(tǒng)可能是通過(guò)激活成骨細(xì)胞上的β2-AR進(jìn)而激活破骨細(xì)胞分化因子RANKL來(lái)間接發(fā)揮作用的[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,激活實(shí)驗(yàn)鼠β2-AR可導(dǎo)致其成骨細(xì)胞數(shù)量、骨形成率和骨量減少;而抑制β2-AR則可明顯提高大鼠成骨細(xì)胞數(shù)量、骨礦物沉積率和骨量[16]。體外研究表明,激活成骨細(xì)胞上的β2-AR可抑制c-MYC基因的表達(dá),進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞的增殖和骨形成[17]。激活骨髓基質(zhì)干細(xì)胞上的β2-AR,可以激活PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨形成[18]。研究發(fā)現(xiàn),去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織β2-AR表達(dá)升高,骨碎補(bǔ)總黃酮可以降低模型大鼠骨組織β2-AR表達(dá),發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[19]。本研究中去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織β2-AR表達(dá)降低,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相反[19],其原因尚未清楚,需要進(jìn)一步深入研究闡明。

    前期研究發(fā)現(xiàn),去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清及骨組織RANKL表達(dá)顯著增加,OPG表達(dá)顯著下調(diào),OPG/RANKL比值減少,壯骨止痛方能夠顯著降低模型大鼠血清及骨組織RANKL表達(dá),上調(diào)OPG表達(dá),提高OPG/RANKL比值[3,20]。本研究中,去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清CGRP含量顯著下降,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)顯著下調(diào);壯骨止痛方干預(yù)后,各劑量組大鼠血清CGRP含量顯著增加,骨組織β2-AR蛋白表達(dá)顯著上調(diào);壯骨止痛方不同劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)壯骨止痛方可能通過(guò)調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠CGRP及β2-AR表達(dá),作用于OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路,發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用,其具體作用環(huán)節(jié)還需進(jìn)一步深入研究。

    [參考文獻(xiàn)]

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