白及蔗糖合酶基因結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析

羅才林 ，徐德林，錢 剛，潘胤池，陳紅波，謝 欣，上官燕妮，李 林

(遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb . f.]是蘭科白及屬草本單子葉植物，又名甘根、白根、良姜、紫蘭等，主要分布于我國(guó)貴州、四川、云南、湖南、安徽等省份。白及是我國(guó)重要中藥材之一，主要功效有收斂止血、消腫生肌[1]等作用。由于白及含膠狀成分，具有較好的止血作用，可顯著縮短凝血時(shí)間[2]，可以治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥狀[3]，具有可觀的藥用價(jià)值和應(yīng)用前景?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明白及中含有豐富的聯(lián)苯類、菲類、二氫菲類等，其具有抗腫瘤、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)傷口愈合等作用[4-6]，這些化學(xué)成分被認(rèn)為可能是白及發(fā)揮抗腫瘤、抗炎和抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

蔗糖合酶(sucrose synthase)是植物的光合作用產(chǎn)物蔗糖進(jìn)入各種代謝途徑所必需的關(guān)鍵酶之一，蔗糖合酶的獨(dú)特之處在于它可以催化蔗糖代謝的可逆反應(yīng)，更重要的是，蔗糖合酶催化蔗糖的合成和分解時(shí)幾乎不消耗能量的方式，在不需要其他酶的參與下，允許蔗糖從“庫(kù)”快速轉(zhuǎn)化為“源”[8]。這些特點(diǎn)使蔗糖合酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。已有研究表明蔗糖合酶參與淀粉合成[9]、纖維細(xì)胞分化[10]、細(xì)胞壁合成[11]和抗逆性[12]等生命活動(dòng)，還能為機(jī)體提供核苷單糖供體，可使蔗糖合酶基因作為一個(gè)催化成分而影響核苷單糖的生物合成過程，具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前已在花生[13]、甜高粱[14]、甜瓜[15]和鐵皮石斛[16]等多種高等植物中分離得到了蔗糖合酶基因，但有關(guān)白及蔗糖合酶基因結(jié)構(gòu)與功能的研究還未見報(bào)道。本研究通過從構(gòu)建的白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑取出蔗糖合酶基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，分析該基因序列的結(jié)構(gòu)、預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)及功能結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，為在分子水平上分析高等植物的蔗糖合酶的保守結(jié)構(gòu)域研究提供基礎(chǔ)資料，對(duì)揭示蔗糖合酶在白及中的生物學(xué)功能以及了解其在整個(gè)糖代謝具有重要意義，也為深入分析其它物種蔗糖合酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的白及為本課題組采集自獲得“國(guó)家地理保護(hù)標(biāo)志產(chǎn)品”的“白及之鄉(xiāng)”貴州省正安縣的地方大規(guī)模種植品系“正安白及”，收獲田間自由散粉所結(jié)的蒴果，在實(shí)驗(yàn)室組培出幼苗后移栽至室外。

1.2 白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建 提取白及不同生育階段根、莖、葉、花、蒴果的總RNA進(jìn)行質(zhì)和量的測(cè)定后進(jìn)行5G數(shù)據(jù)量的mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。Trinity Method對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行denovo組裝，進(jìn)一步將unigene序列進(jìn)行信息學(xué)注解，從中挑選出被初步注解為蔗糖合酶的序列，電子克隆后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 序列的生物信息學(xué)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用NCBI的BLAST在線分析軟件進(jìn)行白及蔗糖合酶核苷酸序列比對(duì)分析，并利用ORF finder分析蔗糖合酶核苷酸序列的開放閱讀框；采用Expasy Prot Param分析白及蔗糖合酶的分子量、等電點(diǎn)和氨基酸組成；使用在線工具SOPMA 分析白及蔗糖合酶基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并用軟件SWISS MODEL進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)的三維建模；在線軟件EBI分析其蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用DNAMAN(6.0)對(duì)多物種氨基酸序列比對(duì)；使用MEGA6.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建多物種的蔗糖合酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹；應(yīng)用在線工具Psort對(duì)亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析，在線工具Profun進(jìn)行功能分類預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 蔗糖合酶序列與氨基酸理化性質(zhì)特征分析 從白及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選出初步注解為蔗糖合酶的unigene，將其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知核酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與不同物種中的蔗糖合酶序列高度相似。該序列全長(zhǎng)為2 957 bp，ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ orfig.cgi)查找開放閱讀框(ORF)發(fā)現(xiàn)，該序列包含一個(gè)完整的開放閱讀框，全長(zhǎng)2 451 bp，共編碼816個(gè)氨基酸殘基。Expasy Prot param (http://web.expasy.org/prot-param)軟件預(yù)測(cè)顯示白及蔗糖合酶由20種氨基酸組成，其中Leu和Ser含量最高，分別為11.2%和8.3%，不含Pyl和Sec。該蛋白分子量為93.09 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.97，原子組成為C4211H6532N1128O1212S23，負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)109個(gè)，正電荷殘基(Arg + Lys)90個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為31.51，表明該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。將該基因序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(GI:ANW09660.1)。

2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 對(duì)白及蔗糖合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析表明主要的結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，符合SuSy蛋白的典型特征(見圖1)。分布比例上看，該基因816個(gè)氨基酸殘基中，396個(gè)氨基酸殘基(占48.53%)為α-螺旋結(jié)構(gòu)( Alpha helix)，129個(gè)氨基酸殘基(15.81%)為線狀結(jié)( Extended strand)，201個(gè)氨基酸殘基(24.63%)為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(Random coil)，90個(gè)氨基酸殘(11.03%)為β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)。從分布位點(diǎn)上來看，C端和N端富含α-螺旋，而無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

藍(lán)色代表α-螺旋; 紅色代表延伸鏈; 綠色代表β-轉(zhuǎn)角; 紫色代表不規(guī)則卷曲。圖1 白及蔗糖合酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 結(jié)構(gòu)域與三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 利用在線工具EBI(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，白及蔗糖合酶包括蔗糖合酶功能域(N端)和糖基轉(zhuǎn)移功能域(C端)。蔗糖合成相關(guān)的功能區(qū)域(sucrose_synth)在第9個(gè)氨基酸到第555個(gè)氨基酸，糖基轉(zhuǎn)移功能域(glycos transf 1)在第561個(gè)氨基酸到第741個(gè)氨基酸是與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的區(qū)域(見圖3)。在Swiss-Model顯示，白及SuSy蛋白序列與擬南芥的SuSy蛋白同源性為74.75%。以擬南芥的結(jié)構(gòu)為模板，構(gòu)建白及SuSy蛋白的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2。

2.4 氨基酸序列同源性分析 以白及(GI:ANW09660.1)及其近緣屬植物的鐵皮石斛(GI:ALS55906.1)、雙子葉的模式植物甜菜(GI:AAK65960.1)氨基酸序列進(jìn)行Alignment多重比對(duì)(見圖3)。比對(duì)發(fā)現(xiàn)，白及蔗糖合酶與鐵皮石斛蔗

糖合酶的氨基酸序列表現(xiàn)出高度同源性，達(dá)91.54%，從全序列差異位點(diǎn)來看，主要的差異位點(diǎn)在N端，鐵皮石斛有約40個(gè)氨基酸殘基的缺失，在氨基酸序列長(zhǎng)度上短于其他兩種材料。另外，白及蔗糖合酶與甜菜的氨基酸序列相比，同源性為69.45%，他們?cè)贜端、C端的保守性較差，而在其他區(qū)域具有較高的相似度。三種材料的蔗糖合酶氨基酸序列相比，中部仍然存在大量完全一致的區(qū)段，這說明蔗糖合酶基因在親緣關(guān)系較近的植物中的氨基酸序列表現(xiàn)出較高的保守性。

圖2 白及蔗糖合酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

黑色背景表示同源性為100%，藍(lán)色背景表示同源性為66.7%，“·”表示氨基酸缺失ANW09660.1 ：紫花白及；ALS55906.1：鐵皮石斛；AAK65960.1：甜菜。圖3 白及蔗糖合酶和鐵皮石斛及甜菜氨基酸序列同源性比對(duì)

2.5 亞細(xì)胞定位及功能預(yù)測(cè) 采用Psort(http://psort.nibb.acform)在線軟件對(duì)白及蔗糖合酶的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果為：定位于細(xì)胞質(zhì)中的概率為47.8%，細(xì)胞核中的概率為26.1%，線粒體中的概率為26.1%，表明該酶主要存在細(xì)胞質(zhì)中。采用ProtFun (http://www.cbs. dtuices/ProtFun/)對(duì)白及蔗糖合酶的功能預(yù)測(cè)，則表明該蛋白具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(40.2%)、轉(zhuǎn)錄(39.3%)、生長(zhǎng)因子(38.1%)功能的概率較高(見表1)。

2.6 白及蔗糖合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析 選取16種單子葉植物和雙子葉植物的蔗糖合酶氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，比較分析不同物種中該基因的進(jìn)化與親緣關(guān)系。從構(gòu)建的進(jìn)化樹中可見，16條氨基酸序列分為單子葉植物組、雙子葉植物組2個(gè)分支，如圖4所示。白及蔗糖合酶歸于單子葉植物組，與鐵皮石斛、金蝶蘭、綠竹在一個(gè)大分支下，這說明該基因在進(jìn)化上與這三者的親緣關(guān)系較近，尤其是與鐵皮石斛的進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析表明各序列均有相同的motif數(shù)目，在序列上的位置稍有不同。

表1蔗糖合酶功能預(yù)測(cè)結(jié)果

功能分類預(yù)測(cè)值概率(%)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)0.08640.2受體0.0052.7荷爾蒙0.00120.6結(jié)構(gòu)蛋白0.00830.1運(yùn)載體0.02422.2離子通道0.01017.5電壓門控離子通0.00625.3陽(yáng)離子通道0.01021.5轉(zhuǎn)錄0.05039.3轉(zhuǎn)錄調(diào)控0.03124.7脅迫因子0.01112.7免疫應(yīng)答0.01012.2生長(zhǎng)因子0.00538.1金屬離子轉(zhuǎn)移0.0092.0

AAM68126.1：甘蔗；ACM69042.1：高粱；CAA26229.1：玉米；CAA78747.1：水稻；EMS59092.1：小麥；AAL50570.1：綠竹；AEA76429.1：金蝶蘭；ANW09660.1：白及；ALS55906.1：鐵皮石斛；AAA97571.1：馬鈴薯；AED92894.1：擬南芥；AEF56625.1：花生；CAA09910.1：豌豆；AEV40460.1：木棉；AIJ28962.1：木薯；AAK65960.1：甜菜。圖4 白及蔗糖合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

參與植物體內(nèi)蔗糖代謝的酶有3種：蔗糖磷酸合成酶( Sucrose Phosphate Synthase, SPS)、蔗糖合酶( Sucrose Synthase, SuSy)、轉(zhuǎn)化酶( Invertase, Ivr)[17]，植物中廣泛存在的一種糖基轉(zhuǎn)移酶是蔗糖合酶[18]，也是催化蔗糖代謝反應(yīng)的關(guān)鍵酶。在UDP存在時(shí)，蔗糖合酶可催化蔗糖分解生成UDP-葡萄糖和果糖的可逆反應(yīng)[19]。而UDP-葡萄糖則作為糖基供體，為生物合成糖苷、寡糖、多糖和糖蛋白等含糖基化合物提供糖基[20]。這些特點(diǎn)使蔗糖合酶能影響植物的呼吸、碳水化合物的生物合成及利用等過程，因此研究植物蔗糖合酶及其功能是揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的重要內(nèi)容，而且已經(jīng)有了較大進(jìn)展[21]。對(duì)白及的蔗糖合酶序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有利于進(jìn)一步了解白及蛋白所發(fā)揮的生理作用與代謝功能。

用蛋白質(zhì)的氨基酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹分支能顯示物種間的親緣關(guān)系，還能評(píng)價(jià)蛋白功能的相關(guān)性，由于植物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化過程中，相關(guān)生理功能的基因因其保護(hù)作用而表現(xiàn)得相對(duì)保守[22]。本研究對(duì)蔗糖合酶進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示白及與親緣關(guān)系較近的鐵皮石斛同處于一個(gè)分支上，其核苷酸序列同源性高達(dá)91%。進(jìn)一步選擇與白及親緣關(guān)系差異較大和較小的2個(gè)物種進(jìn)行蔗糖合酶氨基酸序列的多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與鐵皮石斛有高度同源性(91.54%)，說明植物蔗糖合酶氨基酸序列的一致性很高，是相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)蛋白。而近年來的多種研究分析也表明蔗糖合酶基因在不同的物種中具有功能的保守性。

預(yù)測(cè)白及蔗糖合酶氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)其具有典型的蔗糖合酶結(jié)構(gòu)，蔗糖合酶基因都有蔗糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，基本單位結(jié)構(gòu)域是以α-螺旋結(jié)構(gòu)、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)、線狀結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角相互作用形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步折疊形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。蔗糖合成酶在以下反應(yīng)中催化蔗糖的合成：UDP-葡萄糖+ D-果糖= UDP +蔗糖，而蔗糖合酶的羧基末端區(qū)域?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶能催化糖部分從激活的供體分子轉(zhuǎn)移到特定的受體分子，從而形成糖苷鍵。由此可以說明蔗糖合酶在植物的代謝網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。

蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞可以決定其功能，植物的蔗糖合酶基因主要以可溶性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，蔗糖合酶能迅速變化其在細(xì)胞中的存在方式來行使不同的生理功能。當(dāng)蔗糖合酶存在于細(xì)胞質(zhì)中以可溶性形式時(shí)，主要為細(xì)胞的能量代謝和淀粉的合成提供蔗糖分解的產(chǎn)物[23]，本文推測(cè)的白及蔗糖合酶是存在于細(xì)胞質(zhì)中的可溶性穩(wěn)定蛋白，而在大麥和黃瓜等植物中也發(fā)現(xiàn)了定位在細(xì)胞質(zhì)中的蔗糖合酶[24-25]。白及蔗糖合酶的功能預(yù)測(cè)主要是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)檎崽鞘侵匾男盘?hào)分子，可以參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，并且蔗糖合酶通過介導(dǎo)的蔗糖代謝反應(yīng)釋放的己糖，其作為信號(hào)分子直接感知或者通過能量和代謝物之間的改變間接感知上游信號(hào)從而觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]。本研究首次對(duì)白及蔗糖合酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步闡明蔗糖合酶的作用機(jī)制及功能應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，為植物白及蔗糖合酶基因的分子研究提供了理論依據(jù)及基礎(chǔ)資料。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 萬大群,趙仁全,劉海,等. 白及的成分、藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè),2017,26(2):93-96.

[2] 吳宗德, 劉漢君, 孫穎媛. 白芨粉治療消化性潰瘍60例療效觀察[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2004,27(3):255-256.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部) [S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015.

[4] 湯逸飛,阮川芬,應(yīng)晨,等.白及屬植物化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2014,45(19) : 2864.

[5] 寇澤琪,閆德彪,馮鋒.天然聯(lián)芐類化合物研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2013,25(9):1-6.

[6] 孫愛靜,龐素秋,王國(guó)權(quán).白及化學(xué)成分與抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2016,51(2):101-104．

[7] 馬先杰,崔保松,韓少偉等.中藥白及化學(xué)成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2017,42(8):1578-1584.

[8] Fu H, Park W D.Sink- and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes in potato[J]. Plant Cell, 1995, 7(9):1369-1385.

[9] Chourey P S, Nelson O E. Theenzymatic deficiency conditioned by the shrunken-1 mutations in maize [J].Biochemical Genetics, 1976, 14(11-12):1041-1055.

[10]Fujii S, Hayashi T,Mizuno K. Sucrosesynthase is an integral component of the cellulose synthesis machinery [J].Plant and Cell Physiology, 2010, 51(2):294-301.

[11]Coleman H D, Yan J, Mansfield S D. Sucrose synthase affects carbon partitioning to increase celluloseproduction and altered cell wall ultrastructure [J].PNAS,2009,106(31):13118-13123.

[12]Marana C, Garcia-Olmedo F, Carbonelo P. Different expressionof twotypes of sucrose synthaseencoding genes in wheat inresponse to anaerobiosis, cold shock and light[J].Gene,1990, 88(2):167-172.

[13]何美敬,劉立峰,穆國(guó)俊,等.花生蔗糖合酶基因(SuSy)的克隆和干旱脅迫表達(dá)分析[J].作物學(xué)報(bào), 2012, 38(12): 2139-2146.

[14]劉洋,趙香娜,岳美琪,等.甜高粱蔗糖合成酶基因(Susy2)的克隆及結(jié)構(gòu)和功能分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2010,18(1):24-29.

[15]Wen X, Zhang W, Feng Y, et al. Cloning and characterization ofa sucrose synthase-encoding gene from muskmelon[J]. MolBiol Rep, 2010, 37(2):695-702.

[16]孟衡玲,段承俐,蕭鳳回,等.鐵皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(7):833-837.

[17]張明方,李志凌.高等植物中與蔗糖代謝相關(guān)的酶[J].植物生理學(xué)通訊,2002,38(3):289-295.

[18]Klotz K L,Haagenson D M.Wounding, anoxia and cold induce sugarbeet sucrose synthase transcriptional changes that are unrelated to protein expression and activity[J]. J Plant Physiol, 2008, 16(4):423-434.

[19]Persia D, Cai G, Del Casino C,et al.Sucrose synthase is associated with the cell wall of tobacco pollen tubes[J]. Plant Physiol, 2008, 147(4) :603-618.

[20]李麗娜,孔建強(qiáng).植物蔗糖合酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物報(bào),2015,31(9):904-913.

[21]Baier M C, Keck M, G?dde V, et al. Knockdown of the symbiotic sucrose synthase MtSucS1 affects arbuscule maturation and maintenance in mycorrhizal roots of Medicago truncatula[J]. Plant Physiology, 2010, 152(2):1000-1014.

[22]錢剛,平軍嬌,張珍,等.三種棱型大麥脫水素6(DHN6)的性質(zhì)與蛋白質(zhì)進(jìn)化分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011,30(3):322-329.

[23]房經(jīng)貴,朱旭東,賈海鋒,等.植物蔗糖合酶生理功能研究進(jìn)展[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,40(5):759-768.

[24]Barrero-Sicilia C, Hernando-Amado S, González-Melendi P, et al. Structure, expression profile and subcellular localisation of four different sucrose synthase genes from barley[J]. Planta, 2011, 234(2):391-403.

[25]Ruan Y L,Llewellyn D J,Furbank R T.Suppression of sucrose synthase gene expression represses cotton fiber cell initiation,elongation,andseed development[J].The Plant Cell,2003,15(4):952-964.

[26]Li L,Sheen J. Dynamic and diverse sugar signaling[J].Current Opinion in Plant Biology,2016,33:116-125.