內蒙古自治區(qū)馬鈴薯黑痣病病原菌（菌核）存活力及地下侵染研究

王曉嬌，曹春梅，逯春杏，許 飛，劉秉琦

（1.內蒙古農牧業(yè)科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.內蒙古農業(yè)大學，內蒙古 呼和浩特 010018）

馬鈴薯黑痣病是一種以帶病種薯和土壤傳播的真菌性病害，由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，主要危害馬鈴薯幼芽、莖基部及塊莖，會造成馬鈴薯缺苗斷壟，發(fā)病嚴重時將導致植株死亡[1]，收獲后薯塊商品性大大降低。近幾年來，隨著中國馬鈴薯種植效益的不斷提高，種植面積隨之不斷擴大，許多馬鈴薯種植區(qū)出現(xiàn)倒茬困難，重迎茬問題普遍發(fā)生，不同地區(qū)之間種薯調用頻繁，導致馬鈴薯黑痣病發(fā)生逐年加重[2,3]。據(jù)曹春梅等[4]調研，在內蒙古馬鈴薯種植區(qū)，一般田塊馬鈴薯黑痣病發(fā)病率在5%～10%，重癥田塊發(fā)病率可達到70%～80%，收獲后薯塊帶菌率最高可達100%。目前，馬鈴薯黑痣病己成為內蒙古地區(qū)馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的一大障礙，嚴重影響著馬鈴薯的產量和質量，阻礙了薯業(yè)健康快速發(fā)展，同時大大挫傷了廣大農民種植戶種植馬鈴薯的積極性[5]。馬鈴薯黑痣病在化學藥劑防治方面已經有了新突破，在一定程度上可以預防和控制黑痣病的大面積發(fā)生，但在實際生產中如何根據(jù)環(huán)境變化來提前有效預防病害發(fā)生，減少農藥的使用量，降低生產成本，還沒有相關報道，這就需要對適合病原菌生存發(fā)展的環(huán)境具有一定的把控。本試驗研究內蒙古不同地區(qū)病原菌（菌核）的萌發(fā)、萌發(fā)能力的喪失和地下侵染能力與環(huán)境的關系，為馬鈴薯黑痣病病害系統(tǒng)治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離與鑒定

從內蒙古集寧區(qū)、武川縣、達茂旗、四子王旗、商都縣、固陽馬鈴薯種植區(qū)，調查采集馬鈴薯黑痣病的罹病標本（病莖或病薯）帶回實驗室，采用常規(guī)的組織分離法，進行分離。用解剖刀取病斑邊緣3～5 mm的小塊或是薯塊上的小黑點，先后放入75%的酒精和0.1%升汞中進行表面消毒，然后再用滅好菌的純凈水沖洗2～3次，放到吸水紙上吸干表面水分，再放入固體PDA平板上，每個平板上可放置2～3個，并放于25℃下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。如有菌絲長出，在無菌條件下，用牙簽將尖端菌絲移入另一固體PDA平板上進行純化培養(yǎng)，將分離好的認為是馬鈴薯立枯絲核菌的菌株進行鏡檢、形態(tài)學鑒定和致病性測定，最終確認為病原菌，保存在4℃的PDA培養(yǎng)基上，備用。

1.2 不同溫度對病原菌萌發(fā)的影響

將選取的菌株（表1）接種到PDA培養(yǎng)基上進行活化，活化后用打孔器打出直徑為5 mm的待測菌株菌餅，再接種到直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)基平板正中央，每個菌株3次重復，共270（6個地點×每個地點3個菌株×3次重復×5個溫度）皿，分別放置在5，15，25，30和35℃的光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，觀察測量病原菌的生長情況，用十字交叉法每天測量每個菌株生長直徑。

表1 黑痣病菌株編號及其采集地點Table 1 Rhizoctonia solani strains isolated from potatoes in different cites

1.3 不同溫度對菌核萌發(fā)的影響

將從集寧區(qū)、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)采集的60個（每個地區(qū)10個菌株）黑痣病菌株進行活化，接種到PDA培養(yǎng)基中，每個菌株活化10皿，培養(yǎng)50 d后，每個培養(yǎng)皿中取出15個形成的菌核，合計每個地區(qū)共取出1 500個菌核。在每個培養(yǎng)皿中放入2張用無菌水浸濕的濾紙，浸濕程度以倒置不滴水為宜，將以上準備好的各地區(qū)供試菌核，放置到培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿均勻放置100個菌核，分別放置在5，15，25，30和35℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個地區(qū)、每個溫度3次重復，定期觀察每個培養(yǎng)皿中菌核的萌發(fā)情況，觀察時可采用放大鏡，用鑷子取出已經萌發(fā)的菌核，不間斷的觀察7 d，計算出萌發(fā)率。

1.4 不同埋藏深度對菌核萌發(fā)的影響

將從集寧區(qū)、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)采集的60個（每個地區(qū)10個菌株）黑痣病菌株進行活化，接種到PDA培養(yǎng)基中，每個菌株活化3皿，培養(yǎng)50 d后，在每個培養(yǎng)皿中取出5個菌核，將取出的菌核混勻后裝入紗袋中（紗袋大小約15 cm×20 cm），每袋裝入約大小一致的菌核100個。在內蒙古農牧業(yè)科學院試驗地內，設置菌核位于泥土表層下5，10和15 cm 3個處理深度，重復3次，于5月15日埋藏，埋藏10，15，20，25和30 d觀察菌核萌發(fā)情況，每觀察一次取出已萌發(fā)菌絲的菌核，可采用放大鏡進行觀察，用鑷子取出已經萌發(fā)的菌核，沒有萌發(fā)的菌核再次埋藏，統(tǒng)計累計萌發(fā)率。

1.5 不同地區(qū)對地下埋藏菌核萌發(fā)的影響

將從集寧區(qū)、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)采集的60個（每個地區(qū)10個菌株）黑痣病菌株進行活化，接種到PDA培養(yǎng)基中，每個菌株活化3皿，培養(yǎng)50 d后，在每個培養(yǎng)皿中取出10個菌核，將取出的菌核混勻后，裝入紗袋中，每袋裝入約大小一致的菌核100個。在內蒙古農牧業(yè)科學院試驗地、武川縣、固陽縣、達茂旗、四子王旗和商都縣，設置菌核位于泥土表層下15 cm深度，重復3次，于5月20日埋藏，埋藏30 d后，觀察菌核萌發(fā)情況，統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.6 菌核的多次萌發(fā)試驗

將從集寧區(qū)、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)采集的60個（每個地區(qū)10個菌株）黑痣病菌株進行活化，接種到PDA培養(yǎng)基中，每個菌株活化1皿，培養(yǎng)50 d后，在每個培養(yǎng)皿中取出5個菌核，合計共取出300個菌核進行試驗，將菌核混勻后置于含2層潮濕濾紙的培養(yǎng)皿中，倒置不滴水為宜，每皿50粒，放置6皿，將培養(yǎng)皿放到恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，觀察培養(yǎng)皿中菌核的萌發(fā)情況，16～20 h觀察一次，用鑷子取出已經萌發(fā)出菌絲的菌核，將萌發(fā)的菌核再晾干保存，連續(xù)觀察3 d后，統(tǒng)計并計算出萌發(fā)率。再將萌發(fā)后晾干的菌核進行2次萌發(fā)，按照相同做法，再進行第3次和第4次萌發(fā)，統(tǒng)計并計算出每次的萌發(fā)率。

1.7 菌株地下侵染能力試驗

本試驗采用土壤拌菌法，土壤∶蛭石按3∶1比例均勻攪拌后再將來自集寧區(qū)、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)的菌株以1/5皿的量接種到每個塑料桶中（塑料桶體積為30 cm×50 cm），每個地區(qū)選取3個菌株，每個菌株3次重復，接種54桶，種薯品種選用‘克新1號’原原種，種薯用0.5%的高錳酸鉀消毒10 min，播種深度為10 cm，每盆5塊種薯，塑料桶隨機排列，定期定量加水調節(jié)土壤濕度，播種120 d后，調查每株馬鈴薯植株的發(fā)病情況，在整個試驗過程中，除了土壤中菌種不同外，其他生長條件均保持一致。

2 結果與分析

2.1 溫度對病原菌萌發(fā)的影響

圖1 病原菌生長速度與溫度的關系Figure 1 Relation between pathogen growth rate and temperature

由圖1可以看出，不同地區(qū)的病原菌在5及5℃以上均可以萌發(fā)生長，但溫度較低時生長較慢；從生長起始溫度看，各地區(qū)病原菌無顯著差異，隨著溫度的升高，各地區(qū)病原菌生長速度均是上升的趨勢；同一溫度下不同地區(qū)病原菌生長速度出現(xiàn)顯著性差異，25℃時，固陽病原菌生長速度最快3.33 mm/h，其次為達茂旗2.92 mm/h，集寧區(qū)2.85 mm/h，溫度30℃時，固陽病原菌生長速度2.63 mm/h，集寧區(qū)2.36 mm/h，達茂旗2.24 mm/h，顯著高于其他3個地區(qū)，初步說明固陽、集寧區(qū)、達茂旗病原菌生長能力高于其他3個地區(qū)，溫度達到35℃病原菌生長速度降低，但仍處于生長狀態(tài)。從試驗數(shù)據(jù)總體看，各地區(qū)病原菌在5～35℃均可以生長，適應溫度范圍較大，最適宜生長溫度為25～30℃。

2.2 溫度與菌核萌發(fā)的關系

圖2為培養(yǎng)24 h后調查各地區(qū)病原菌不同溫度下的萌發(fā)情況，從圖2可以看出，不同地區(qū)菌核的萌發(fā)起始溫度不同，在5℃下，武川區(qū)和固陽區(qū)菌核萌發(fā)率已較高，分別為43.44%、38.33%，顯著高于其他地區(qū)；隨著溫度的升高，各地區(qū)菌核萌發(fā)率升高，且萌發(fā)速度較快，24 h內達茂旗菌核萌發(fā)率達到100%。不同地區(qū)菌核在同一溫度下萌發(fā)率不同，在25℃下，固陽區(qū)萌發(fā)率95%，集寧區(qū)為65.67%，差異顯著。從圖2中還可看出，各地區(qū)菌核最適宜萌發(fā)溫度為30℃；圖3為培養(yǎng)48 h后調查各地區(qū)病原菌不同溫度下的萌發(fā)情況，從圖3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，在不同溫度下，不同地區(qū)的菌核均可以萌發(fā)，萌發(fā)率達到96%以上。從試驗結果看，不同溫度下，不同地區(qū)菌核萌發(fā)速度不同，但長時間內，各地區(qū)菌核均可以萌發(fā)生長。

圖2 24 h調查菌核萌發(fā)情況Figure 2 Sclerotium germination in 24 h

圖3 48 h調查菌核萌發(fā)情況Figure 3 Sclerotium germination in 48 h

圖4 埋藏深度與菌核萌發(fā)的關系Figure 4 Relation between buried depth and sclerotium germination

2.3 埋藏深度與菌核萌發(fā)的關系

從圖4可以看出，菌核在不同深度的埋藏下，在埋藏10～20 d，不同埋藏下菌核萌發(fā)速度、萌發(fā)率上存在顯著差異；埋藏深度10～15 cm，更適合菌核的萌發(fā)，可能的原因為埋藏5 cm深度離地表較淺，土壤濕度出現(xiàn)上下波動，而影響菌核的萌發(fā)；隨時間的延長，埋藏30 d，不同深度的菌核均全部萌發(fā)，說明不同土壤深度影響菌核的萌發(fā)，但時間足夠長，環(huán)境穩(wěn)定不同深度菌核也會全部萌發(fā)。

2.4 不同地區(qū)與菌核萌發(fā)的關系

埋藏30 d后，將埋藏在內蒙古農牧業(yè)科學院試驗地、武川縣、固陽、達茂旗、四子王旗和商都縣6個地區(qū)裝有菌核的紗袋全部取出，用擴大鏡進行觀察。試驗數(shù)據(jù)顯示，不同地區(qū)埋藏的菌核均萌發(fā)，萌發(fā)率為100%，如圖5所示。

由試驗可知，內蒙古的各地區(qū)土壤環(huán)境均適宜病原菌的萌發(fā)。

2.5 菌核多次萌發(fā)的特性

表2試驗結果顯示，菌核第1次萌發(fā)率為98.00%，第2次萌發(fā)率為66.55%，第3次萌發(fā)率46.32%，第4次萌發(fā)率為31.76%。由此可以看出，立枯絲核菌菌核具有多次萌發(fā)的特性，但隨著萌發(fā)次數(shù)的增多，萌發(fā)率逐漸遞減。這也可以說明馬鈴薯黑痣病病原菌的菌核可在地下存活多年，并具有一定的萌發(fā)能力，從試驗結果來看，菌核具有這種多次萌發(fā)的特性，可能是一種對自身的保護性機制，在土壤中可以延長其存活時間，保存其活力，使菌株存活和再生。

圖5 菌核萌發(fā)Figure 5 Sclerotium germination

表2 菌核萌發(fā)率Table 2 Sclerotium germination rate

表3 不同地區(qū)病原菌地下侵染塊莖致病率Table 3 Pathogenesis rate of different region's sclerotium

2.6 菌株的地下侵染能力

表3結果顯示，不同地區(qū)病原菌，在適宜的環(huán)境下，均能萌發(fā)侵染致病，且致病率較高，致病率為84.85%～97.73%，說明內蒙古各地區(qū)馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌病原菌對馬鈴薯的侵染致病能力較強，應提前預防和防治馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。

3 討 論

不同地區(qū)的馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌的萌發(fā)與溫度有很大關系，在5℃及高于5℃開始萌發(fā)，最適宜萌發(fā)溫度25～30℃，與李清銑和夏正俊[6]的研究結果較一致，不同來源的R.solani菌絲可在15～35℃正常生長，最適宜的生長溫度為25℃。內蒙古各地區(qū)病原菌在同一溫度下萌發(fā)速度不同，侵染能力不同，所以不同地區(qū)應在不同時間或溫度環(huán)境下采取不同防治措施，當土壤溫度達到15℃以上，且濕度適宜，內蒙古各地區(qū)均應開始預防馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯黑痣病的發(fā)生遲早決定于當年的溫度和土壤濕度的相關性還有待繼續(xù)研究，了解不同地區(qū)馬鈴薯黑痣病病原菌的萌發(fā)情況，對當?shù)胤N植者測報和防治黑痣病的發(fā)生具有重要意義。

黑痣病病原菌的菌核在不同地區(qū)，不同土壤深度，不同生態(tài)條件下均能萌發(fā)侵染，說明其生命力相當頑強，內蒙古各地區(qū)應加強對馬鈴薯黑痣病的預防。

研究者發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯黑痣病病原菌的菌絲體在土壤中植株殘體上越冬，病原菌的菌核在塊莖上或土壤中過冬[7,8]，這些菌核或菌絲體是翌年侵染的侵染源[9]，病菌可在土壤中存活2～3年[10]。本試驗中發(fā)現(xiàn)，內蒙古不同地區(qū)的菌核均具有多次萌發(fā)和地下侵染能力，經過4次萌發(fā)，菌核仍具有一定的萌發(fā)力，說明菌核可在地下存活多年，對前人的研究進行了補充，這也指導馬鈴薯生產者在生產過程中應輪作倒茬4年以上才可減少馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，內蒙古不同地區(qū)的病原菌對馬鈴薯都具有較強的侵染力，且病原菌菌核萌發(fā)初次侵染寄主后，可以隨雨水、地下水進行漂流，再引起多次侵染，這樣對黑痣病病害水平的擴展將起著非常重要的作用。

馬鈴薯黑痣病立枯絲核菌的這些特性給種植戶在有效防治上帶來了更多復雜而嚴峻的問題。到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)對黑痣病有高抗或者免疫的馬鈴薯品種，因此對馬鈴薯黑痣病的防治也只能根據(jù)每年病害的流行發(fā)生規(guī)律和病菌自身的生態(tài)學特點，結合多種方法、措施進行全方面的綜合防治。通過本試驗的研究，掌握了內蒙古部分地區(qū)馬鈴薯黑痣病發(fā)病情況及與溫度的相關性，在實際生產和預防馬鈴薯黑痣病發(fā)生上具有重要指導意義，但對于黑痣病病原菌的萌發(fā)和濕度及溫濕度兩者共同的綜合作用關系還不是很清楚，需要繼續(xù)進行研究發(fā)現(xiàn)。

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