SOX9及WNT信號(hào)通路分子在高氧暴露致早產(chǎn)大鼠肺損傷中的表達(dá)及意義

嚴(yán)隆麗，全裕鳳，張 華，柳秋菊，趙日紅，劉 曼

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是新生兒常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率隨著胎齡及出生體質(zhì)量的減少而增加，嚴(yán)重威脅到了新生兒的生命及生存質(zhì)量。研究[1]顯示早產(chǎn)兒肺發(fā)育不成熟、長(zhǎng)期吸入高濃度氧、感染等是BPD發(fā)生的常見原因，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前，越來越多研究[2]表明遺傳因素在BPD的發(fā)病中起著重要作用,同時(shí)，與高氧肺損傷相關(guān)的分子機(jī)制也有了較多的研究，但仍然不太完善。WNT信號(hào)通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)胚胎動(dòng)物各器官的發(fā)育起著關(guān)鍵作用，近年來研究[3]證實(shí)其在胚胎肺發(fā)育過程中起著必不可少的作用，貫穿了整個(gè)鼠胚胎肺發(fā)育過程。SOX9因子屬于SOX轉(zhuǎn)錄因子家族，是細(xì)胞核內(nèi)WNT信號(hào)通路的調(diào)控因子[4]，而有關(guān)于高氧暴露后肺組織SOX9表達(dá)的變化以及它與WNT信號(hào)通路在高氧暴露早產(chǎn)大鼠肺組織中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。該研究旨在通過觀察SOX9因子、WNT通路關(guān)鍵因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、淋巴增強(qiáng)因子(LEF-1)以及肺泡表面活性蛋白C(SPC)、α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)因子在高氧暴露后肺組織中的表達(dá)，以了解WNT信號(hào)通路是否參與BPD以及SOX9在高氧暴露后肺組織中的表達(dá)變化，探討B(tài)PD的發(fā)病機(jī)制，為高氧致BPD的治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 用于RT-PCR的試劑主要有TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司)，SOX9引物、β-catenin引物、GAPDH引物、LEF-1引物、SPC引物、α-SMA引物(蘇州泓迅生物科技有限公司)；用于Western blot的試劑和儀器主要有RIPA組織細(xì)胞裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(北京索來寶科技有限公司)，PVDF膜(美國(guó)密理博公司)，兔抗鼠β-catenin單克隆一抗(美國(guó)CST公司)，兔抗鼠SOX9單克隆一抗、兔抗鼠α-SMA單克隆一抗(美國(guó)ABCAM公司)，兔抗鼠LEF-1單克隆一抗、兔抗鼠SPC單克隆一抗(北京ORIGENE公司)，鼠抗GAPDH單克隆一抗、山羊抗兔及兔抗鼠單克隆二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，ECL發(fā)光液(北京全品速生物科技有限公司)。

1.1.2主要儀器 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，JS780 SensiAnsys凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)，Tanon4100全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能公司)，ChemiDo-cXRS圖像采集系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，CYC氧濃度檢測(cè)儀及空氧混合器(廣東鴿子公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型制備SPF級(jí)健康SD大鼠(8～10周齡)購(gòu)自桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌鼠60只(220～250 g)，雄鼠20只(250～300 g),雌雄按3 ∶1夜間合籠交配，次日晨取雌鼠陰道分泌物涂片鏡檢精子記為受孕第1天，將受孕21 d的大鼠剖宮后取出新生鼠即為早產(chǎn)鼠。早產(chǎn)鼠24 h內(nèi)隨機(jī)分為高氧組(Fio2=95%)和空氣組(Fio2=21%)，每組36只，各組再隨機(jī)分為3、5、9 d三個(gè)亞組，每組12只，高氧組置于60 cm×50 cm×40 cm的自制氧箱中，持續(xù)輸入氧氣,每天3次檢測(cè)氧箱內(nèi)氧濃度，維持氧濃度在95%以上，鈉石灰和無水碳酸鈣分別吸收CO2和水分，每24 h定時(shí)開箱0.5 h，添加水、飼料及更換墊料，并與空氣組交換母鼠以避免其因氧中毒致喂養(yǎng)能力下降。

1.3標(biāo)本收集及處理各組早產(chǎn)大鼠分別于實(shí)驗(yàn)3、5、9 d時(shí)用5%水合氯醛按0.006 ml/g進(jìn)行腹腔注射麻醉。開胸，結(jié)扎右支氣管，迅速取下右肺，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。從主支氣管注入4%多聚甲醛維持15 min并置于4%多聚甲醛中過夜固定，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，用于檢測(cè)肺組織病理變化。

1.4RT-PCR法檢測(cè)肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMAmRNA表達(dá)將肺組織取出50～100 mg置于用液氮預(yù)冷的研缽中，研磨成粉末后加入TRIzol提取總RNA，取5 μl RNA置于含EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其完整性，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度，取肺組織總RNA 1 μg逆轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括cDNA 2 μl，上下游引物各1μl，無RNA酶水14 μl，PCR 預(yù)混合物 2 μl，共20 μl反應(yīng)體系。SOX9上游引物5′-TCTACTCCACCTTCACCTACAT-3′，下游引物5′-CTGTGTGTAGACGGGTTGTT-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為131 bp)；β-catenin上游引物5′-CAAGCCACAGGACTACAAGAA-3′，下游引物5′-CAATGTCCAGTCCGAGATCAG-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為107 bp)；LEF-1上游引物5′-GGCGACTTAGCAGACATCAA-3′，下游引物5′-CCTGAGAGGACTGTGTTTGTC-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp)；SPC上游引物5′-GGGTAGCAAAGAGGTACTGATG-3′，下游引物5′-ACCACAACCACGATGAGAAG-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為117 bp)；α-SMA上游引物5′-AGGGAGTGATGGTTGGAATG-3′，下游引物5′-GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為110 bp)；GAPDH 上游引物5′-GCAAGGATACTGAGAGCAAGAG-3′，下游引物5′-GGATGGAATTGTGAGGGAGATG-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為98 bp)。反應(yīng)步驟如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，58.3 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，分別取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加至含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果通過自動(dòng)凝膠圖像分析儀顯示并拍照，分別測(cè)定條帶光密度值，以GAPDH mRNA的基因表達(dá)為內(nèi)參照，計(jì)算SOX9、β-catenin、LEF-1、α-SMA與GAPDH灰度值比，以此值來代表目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5Westernblot法檢測(cè)肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA蛋白表達(dá)取凍存肺組織50 mg于冰上1.5 ml EP管中，剪碎，加入500 μl的RIPA裂解液，超聲3～4次，放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取出上清液即為總蛋白,參考BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行蛋白濃度定量，設(shè)定濃度最低管為標(biāo)準(zhǔn)，把樣品調(diào)成同一濃度，加入樣品溶液，沸水浴加熱15 min后置于冰上冷卻，每孔加40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶室溫封閉4 h后分別加入SOX9一抗、β-catenin一抗、LEF-1一抗、SPC一抗、α-SMA一抗(均按1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min,加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)試劑發(fā)光，曝光1 min，用ChemiDo-cXRS圖像采集系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH(1 ∶1 000)作為內(nèi)參照，Image J軟件檢測(cè)條帶灰度值，計(jì)算SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值，該比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1肺組織病理學(xué)改變空氣3 d組、5 d組、9 d組在低倍鏡(×100)下觀察，可見肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡豐富，大小均一，并且隨著出生天數(shù)的增加肺泡數(shù)量增多。高氧3 d組肺組織見明顯滲出、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血性改變及肺泡壓縮，高氧5 d組可見肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)增寬，9 d組可見肺泡炎癥細(xì)胞明顯減少，肺間隔明顯增寬，小肺泡減少，肺泡腔增大，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂且肺泡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，見圖1。

2.2肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的mRNA表達(dá)高氧組早產(chǎn)大鼠肺組織β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA在3、5、9 d的mRNA表達(dá)均高于空氣組(F=7.705、14.549、9.444、7.974,P<0.05),并且高氧組mRNA相對(duì)表達(dá)量隨氧暴露時(shí)間的增加而增加，SOX9在高氧3、5、9 d mRNA相對(duì)表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)，但仍高于空氣組，在3 d和5 d 時(shí)，SOX9 mRNA表達(dá)與空氣組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),在9 d時(shí)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3肺組織SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的蛋白表達(dá)高氧組早產(chǎn)大鼠肺組織β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA的蛋白表達(dá)均高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空氣組(F=18.747、87.959、9.281、13.886,P<0.05)，SOX9在高氧3 d、5 d的蛋白表達(dá)高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空氣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),在9 d時(shí)，高氧組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

3 討論

圖1 空氣組和高氧組早產(chǎn)鼠在各時(shí)間點(diǎn)的肺組織病理改變 HE×100

圖2 空氣組和高氧組在各時(shí)間點(diǎn)SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)

圖3 空氣組和高氧組在各時(shí)間點(diǎn)SOX9、β-catenin、LEF-1、SPC、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)

WNT信號(hào)通路是一類控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、傳遞細(xì)胞間相互調(diào)控信息的信號(hào)通路，它主要由經(jīng)典WNT信號(hào)途徑和非經(jīng)典WNT信號(hào)途徑組成。經(jīng)典WNT信號(hào)通路即WNT/β-catenin信號(hào)通路，是目前研究最為廣泛的，也是與肺發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)通路，它不僅在肺的早期發(fā)育階段調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)后期肺結(jié)構(gòu)的維持也是起著重要作用,近年來人們也逐漸認(rèn)識(shí)到它在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起的重要作用[5]，包括特發(fā)性肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、BPD等。目前，已有較多關(guān)于經(jīng)典WNT信號(hào)通路與特發(fā)性肺纖維化之間關(guān)系的研究[6]，而研究WNT信號(hào)通路在高氧肺損傷中的作用才剛剛開始。

在WNT/β-catenin途徑中，當(dāng)細(xì)胞外WNT信號(hào)分子蛋白與Fz和低密度脂蛋白相關(guān)蛋白 5/6結(jié)合使胞內(nèi)蓬亂蛋白發(fā)生磷酸化而激活，活化的蓬亂蛋白抑制糖原合成酶3β活性，使β-catenin無法磷酸化，從而避免被泛素-蛋白酶體系降解，β-catenin在胞內(nèi)富集并進(jìn)入胞核與 T淋巴細(xì)胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子 (TCF/LEF)結(jié)合，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，因此Wnt/β-catenin通路信號(hào)活化必然會(huì)使β-catenin的表達(dá)增加[7]。LEF-1和β-catenin作為經(jīng)典WNT信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在高氧3、5、9 d組的mRNA和蛋白表達(dá)量均高于空氣3、5、9 d組，表明經(jīng)典WNT信號(hào)通路在高氧致BPD模型中是處于激活狀態(tài)，提示W(wǎng)NT信號(hào)通路參與了高氧肺損傷。

本研究中空氣各組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，高氧3 d組肺組織見明顯滲出、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血性改變及肺泡壓縮，高氧5 d組和9 d組可見肺間隔增寬及肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，表明成功建立了高氧肺損傷模型。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高氧組肺組織SPC、α-SMA和蛋白表達(dá)均高于空氣組，且隨著高氧暴露天數(shù)的增加表達(dá)量也增加，而空氣各組SPC和α-SMA表達(dá)量未見明顯差異。由于SPC是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生的特異性表面活性蛋白[8]，對(duì)肺泡結(jié)構(gòu)的完整起著重要作用，因此它在高氧組表達(dá)增高提示在高氧情況下Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞不斷的增殖,但是向Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞分化受阻,導(dǎo)致肺泡的修復(fù)受損,代之以纖維細(xì)胞的增生來修復(fù), α-SMA是間葉細(xì)胞的標(biāo)志,表達(dá)在肌成纖維細(xì)胞中[9],因此，高氧組α-SMA表達(dá)高于空氣組，且α-SMA在高氧3、5、9 d的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢(shì)，提示隨著高氧暴露時(shí)間的增加，肺組織纖維化越來越重，這與病理切片結(jié)果相一致。

SOX(SRY_related HMG_box)基因家族是一類編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因,參與多種組織早期胚胎發(fā)育過程，對(duì)多種組織器官的發(fā)育具有重要作用[10]，SOX9是SOXE亞族的一個(gè)成員，有研究[11]顯示它表達(dá)在呼吸道外周上皮祖細(xì)胞中，對(duì)肺分支形態(tài)的形成起著重要作用，也有研究認(rèn)為它在呼吸道上皮細(xì)胞的表達(dá)沒有意義[12]。而有關(guān)SOX9與WNT信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)在不同的實(shí)驗(yàn)研究中有著不同的結(jié)論，在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)SOX9表達(dá)增加與WNT/β-catenin信號(hào)通路激活有關(guān)[13]；在腸的發(fā)育過程中，SOX9被認(rèn)為是WNT信號(hào)通路的直接調(diào)控因子[14]；在肺的發(fā)育過程中，Rockich et al[11]認(rèn)為WNT/β-catenin并不調(diào)節(jié)SOX9的表達(dá)；Ustiyan et al[15]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin在呼吸道上皮祖細(xì)胞中既可促進(jìn)SOX9的表達(dá)，又可抑制SOX9的表達(dá)，可見SOX9與WNT信號(hào)通路的相互作用非常復(fù)雜，而有關(guān)SOX9基因功能改變與早產(chǎn)BPD的關(guān)系,目前國(guó)內(nèi)外尚未開展這方面的研究。

本研究顯示高氧組SOX9的核酸和蛋白表達(dá)量均高于空氣組，以高氧3 d和高氧5 d最為明顯，而高氧3 d組的表達(dá)量又高于高氧5 d組，因此推測(cè)在高氧致急性肺損傷時(shí)，SOX9表達(dá)增加可能是應(yīng)激性增加，是為了抑制WNT信號(hào)通路的激活來保護(hù)肺不受損害，但是隨著高氧暴露時(shí)間的增加，SOX9的表達(dá)逐漸降低，也許與SOX9無法抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活反而被WNT/β-catenin信號(hào)通路抑制有關(guān)。

綜上所述，本研究顯示高氧暴露通過激活WNT信號(hào)通路致早產(chǎn)大鼠肺組織損傷，同時(shí)WNT信號(hào)通路的激活可能是通過抑制Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞向Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞分化，因此肺泡上皮不能正常修復(fù)，從而導(dǎo)致肺組織最后纖維化，而SOX9則可能是通過抑制WNT信號(hào)通路來參與高氧肺損傷。而有關(guān)SOX9及WNT/β-catenin信號(hào)通路在高氧肺損傷中的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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