DBA/2J小鼠耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛早期的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化*

劉 祥 金昌洙 韓鋒產(chǎn)

(濱州醫(yī)學(xué)院,1 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生耳科遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,3 人體解剖學(xué)教研室,煙臺(tái) 264003)

年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss,AHL)即增齡性聾,是聽覺器官隨著年齡的增加而退變,出現(xiàn)雙耳對(duì)稱性、漸進(jìn)性聽力減退,是由環(huán)境因素和基因變異導(dǎo)致的復(fù)雜的病理學(xué)改變[1]。AHL是人群中最為常見的聽覺系統(tǒng)疾病之一,影響著全球數(shù)千萬人的生活[2]。DBA/2J小鼠是研究AHL常用的動(dòng)物模型,其聽力受損發(fā)生較早且呈漸進(jìn)性。掃描電鏡在DBA/2J小鼠成年周齡之前毛細(xì)胞靜纖毛的研究中應(yīng)用相對(duì)較少。Shin等[3]報(bào)道了DBA/2J小鼠1月齡到6月齡的掃描電鏡低倍鏡下可見底回毛細(xì)胞靜纖毛出現(xiàn)漸進(jìn)性丟失,但并未報(bào)道高倍鏡下單個(gè)毛細(xì)胞靜纖毛的病變過程;Perrin等[4]報(bào)道了DBA/2J小鼠5周齡時(shí)耳蝸底回到頂回外毛細(xì)胞靜纖毛長(zhǎng)度的改變,但并未詳細(xì)觀察其他周齡的底回外毛細(xì)胞靜纖毛的變化情況。本研究通過掃描電鏡觀察低周齡DBA/2J小鼠耳蝸毛細(xì)胞頂端的纖毛的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,旨在探討早發(fā)性聽力受損的病因及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及試劑

選購(gòu)DBA/2J小鼠15只(南京大學(xué)—南京生物醫(yī)藥研究院),將雌雄小鼠按照2∶1比例合籠。待新生小鼠周齡達(dá)到2、4周齡和8周齡時(shí),每個(gè)周齡隨機(jī)取6只小鼠并使用1%戊巴比妥鈉(0.25ml/kg)腹腔注射麻醉后進(jìn)行聽力測(cè)試及內(nèi)耳耳蝸取材。1%戊巴比妥鈉(北京普博斯生物);2.5%戊二醛及1%鋨酸(濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心電鏡室提供);EDTA Na2(北京索萊寶)。

1.2 腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response,ABR)測(cè)試小鼠聽力

將小鼠麻醉后置于隔音室(可屏蔽電場(chǎng)和磁場(chǎng)),并置于加熱墊上(維持體溫在37℃～38℃),使用腦干誘發(fā)電位儀(Miami,美國(guó))測(cè)試小鼠聽力。信號(hào)采集細(xì)針電極分別插到小鼠頭頂、右耳腹側(cè)和左耳腹側(cè)的皮下。檢測(cè)刺激頻率分別為click(復(fù)合音)、8、16kHz以及32kHz時(shí)的ABR閾值。

1.3 內(nèi)耳-耳蝸標(biāo)本處理

小鼠麻醉后在立體顯微鏡(S6D型,萊卡,德國(guó))下解剖顳骨,取出完整的內(nèi)耳。參照 Men等[5]及孫建和等[6]的耳蝸掃描電鏡樣本制作方法,將取出的內(nèi)耳用2.5%戊二醛中4℃固定并過夜后用10% EDTA-Na2于室溫下脫鈣16h。修剪內(nèi)耳耳蝸基底膜使毛細(xì)胞暴露完全并置于0.1mol/L PBS中清洗過夜。第3天,1%鋨酸后固定40min再進(jìn)行梯度乙醇脫水。CO2臨界點(diǎn)干燥后在真空離子噴濺儀中(Q 150R S型,Quorum,英國(guó))噴金鍍膜15～20nm。最后將樣品放入掃描電鏡高真空觀察艙內(nèi)等待觀察。

1.4 掃描電鏡觀察

將制備好的耳蝸樣品在掃描電鏡(EVO MA 15/LS型,卡爾蔡司,德國(guó))下觀察。分別采集連續(xù)3個(gè)視野下的×600、×2000以及×10000鏡下放大的掃描電鏡圖片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ABR測(cè)試

結(jié)果顯示,DBA/2J小鼠聽力閾值呈現(xiàn)漸進(jìn)性升高,表明其聽力受損逐漸加重(圖1)。ABR閾值水平高于55(click)、40(8kHz)、35(16kHz) 或60(32kHz) dB SPL時(shí)認(rèn)為有聽力受損。早在4周齡,DBA/2J小鼠在各個(gè)音頻刺激下均出現(xiàn)聽力受損;8周齡時(shí),無論click(復(fù)合音)刺激還是短純音刺激下其ABR閾值均高于60dB SPL(60～80dB SPL為中級(jí)聽力受損)。

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 2周齡時(shí)靜纖毛總體排列尚且規(guī)則 2周齡小鼠靜纖毛排列規(guī)則,沒有出現(xiàn)纖毛束的缺失。在600倍鏡下,2整個(gè)耳蝸底回靜纖毛排列規(guī)則,可見外毛細(xì)胞(out hair cells,OHC)靜纖毛呈倒“V”型3行或者4行排列,內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cells,ZHC)靜纖毛呈單行排列(圖2A)。

2.2.2 纖毛束出現(xiàn)融合變化 在2000倍鏡下,2周齡的DBA/2J小鼠OHC靜纖毛已出現(xiàn)部分纖毛束的融合病變,單根纖毛束之間的界限變模糊,甚至有的數(shù)根纖毛融合成團(tuán)塊狀或者球狀,在掃描電鏡下為高亮的點(diǎn)狀(圖2B)。纖毛束在4周齡時(shí)融合更為嚴(yán)重,電鏡下可見大面積的纖毛束呈團(tuán)塊狀高亮區(qū)(圖2C)。同樣IHC靜纖毛也表現(xiàn)出類似的變化,纖毛束出現(xiàn)球狀融合(氣球樣變)(圖2B、C)。

圖1 聽覺腦干反應(yīng)平均閾值的時(shí)間變化曲線(n=6)Fig 1 Time curves of mean ABR thresholds (n=6)

2.2.3 纖毛束出現(xiàn)軟化 2周齡的DBA/2J小鼠OHC靜纖毛已出現(xiàn)纖毛束的軟化,但未見纖毛束的倒伏。在10000倍鏡下顯示小鼠OHC靜纖毛上端軟化,部分纖毛束出現(xiàn)彎曲,但未出現(xiàn)整體纖毛束的倒伏;IHC靜纖毛除了纖毛束的無規(guī)律排布和部分融合外未見明顯軟化彎曲(圖2E)。

2.2.4 纖毛束出現(xiàn)嚴(yán)重倒伏 4周齡的DBA/2J小鼠靜纖毛出現(xiàn)嚴(yán)重的倒伏。無論OHC靜纖毛還是IHC靜纖毛均呈傾倒的“C”型,纖毛束嚴(yán)重彎曲倒伏貼于毛細(xì)胞上端的頂盤上(圖2C、F)。4周齡時(shí)即使纖毛束出現(xiàn)嚴(yán)重倒伏但并未出現(xiàn)倒“V”型纖毛束的大面積缺失(偶有缺失)。

2.2.5 纖毛束出現(xiàn)嚴(yán)重缺失 8周齡的DBA/2J小鼠倒“V”型纖毛束出現(xiàn)較為嚴(yán)重缺失(區(qū)域性),且纖毛束融合更為嚴(yán)重(圖2D),尤其OHC靜纖毛束融合更為明顯,已無法辨別單根纖毛(圖2G)。

3 討論

動(dòng)物模型通常作為研究年齡相關(guān)的遺傳和生理基礎(chǔ)疾病的重要工具[7]。DBA/2J小鼠是被公認(rèn)的AHL動(dòng)物模型,該小鼠模型不僅表現(xiàn)為年齡相關(guān)性、漸進(jìn)性聽力受損,而且之前的報(bào)道其伴有較為嚴(yán)重的早發(fā)性聽力受損。DBA/2J小鼠在3周齡時(shí)已表現(xiàn)出聽力損失,其聽力閾值上升15～20dB SPL,在14周齡時(shí)接近全聾[8]。DBA/2J小鼠在2個(gè)月就有嚴(yán)重的聽力損失,16kHZ的純音刺激下其ABR閾值高于60dB SPL[9]。本研究ABR測(cè)試結(jié)果也證實(shí)了DBA/2J小鼠確實(shí)存在漸進(jìn)性聽力受損,尤其是4周齡以后(小鼠可以測(cè)聽最小周齡為3周)。因此,研究該模型小鼠的早發(fā)性聽力損失的原因?qū)τ谄渲委熀透纳坡犃p失有著重要作用。

圖2 DBA/2J 小鼠耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛超微形態(tài),掃描電鏡。A：×600; B～D：×2000; E～G：×5000Fig 2 Ultramicroscopic morphology of cochlea hair cell stereocilia of DBA/2J mice,scanning electron microscopeA：×600; B-D：×2000; E-G：×10000.A-D：HCs; E-G：OHCs.A,B,E: 2 weeks; C,F: 4 weeks; D,G: 8 weeks.HCs: Hair cells; OHCs: Out hair cells

3.1 纖毛的漸進(jìn)性丟失是增齡性聾的主要病理過程之一

作為聽覺感受器細(xì)胞的內(nèi)耳耳蝸毛細(xì)胞及其纖毛的漸進(jìn)性丟失是增齡性聾的主要病理過程之一[7]。毛細(xì)胞頂端的靜纖毛在聲音傳導(dǎo)過程中起到了不可缺失的作用。靜纖毛能感受聲波刺激引起毛細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)換作用,將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào),產(chǎn)生聽覺。如果纖毛出現(xiàn)病變將導(dǎo)致聽力受損。Shin等[3]研究認(rèn)為,DBA/2J小鼠2周齡耳蝸底回毛細(xì)胞靜纖毛沒有缺失,1月齡到6月齡的低倍鏡下可見纖毛束出現(xiàn)漸進(jìn)性丟失。本研究結(jié)果顯示,在掃描電鏡600倍鏡下DBA/2J小鼠2周齡耳蝸底回毛細(xì)胞靜纖毛排列規(guī)則,未見缺失。OHC靜纖毛呈倒“V”型多行排列,IHC靜纖毛呈單行“一”字型排列。2周齡時(shí),在掃描電鏡2000倍鏡下小鼠毛細(xì)胞纖毛束頂端可見散在點(diǎn)狀高亮影,掃描電鏡10000倍鏡下可見高亮影為幾根纖毛束的融合。

Perrin等[4]的研究認(rèn)為,DBA/2J小鼠5周齡時(shí)耳蝸底回OHC靜纖毛長(zhǎng)度變短,但并未報(bào)道5周齡之前的纖毛變化情況。本研究結(jié)果顯示,早在2周齡時(shí)的掃描電鏡10000倍鏡下可見DBA/2J小鼠耳蝸底回靜纖毛不僅有融合變化而且出現(xiàn)軟化,4周齡時(shí)雖然未見倒“V”型纖毛束整體缺失但纖毛束整體倒伏較為嚴(yán)重,并且出現(xiàn)單根或者幾根的纖毛丟失,無論OHC靜纖毛還是IHC靜纖毛均如此。

本研究結(jié)果顯示DBA/2J小鼠4周齡時(shí)未見倒“V”型纖毛束明顯缺失,但纖毛束整體倒伏較為嚴(yán)重;8周齡時(shí)出現(xiàn)大面積的倒“V”型纖毛束的丟失。筆者認(rèn)為,早期毛細(xì)胞纖毛束的融合和軟化最終導(dǎo)致其嚴(yán)重倒伏,進(jìn)而出現(xiàn)纖毛束的漸進(jìn)性缺失。這些結(jié)果導(dǎo)致毛細(xì)胞靜纖毛對(duì)聲波刺激的反應(yīng)減弱,進(jìn)而影響聽覺的產(chǎn)生,隨著年齡的增加表現(xiàn)為嚴(yán)重的聽力受損。

3.2 基因缺陷是導(dǎo)致DBA/2J小鼠毛細(xì)胞纖毛束損害主要因素

在基因水平上,DBA/2J小鼠出現(xiàn)早期聽力受損的原因除了Ahl基因位座上被命名為Cdh23 (鈣黏蛋白CDH23)等位基因的突變外,還有位于Ahl 8基因位座上被確認(rèn)的fascin-2(交聯(lián)蛋白FSCN-2)基因的突變[10]。CDH23是鈣黏蛋白超家族的成員之一,它表達(dá)于感覺神經(jīng)上皮細(xì)胞表面,被認(rèn)為與耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛的結(jié)構(gòu)和毛細(xì)胞束的形成有關(guān)[11-13]。fascin-2基因表達(dá)肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白(FSCN-2),FSCN-2 蛋白大量存在于毛細(xì)胞靜纖毛,集中分布于纖毛束的頂端,維持靜纖毛的長(zhǎng)度和硬度[14]。

本研究結(jié)果顯示,早在2周齡的DBA/2J小鼠就出現(xiàn)纖毛束軟化,4周齡出現(xiàn)纖毛束倒伏,推測(cè)其早發(fā)性聽力受損可能是fascin-2基因的突變所產(chǎn)生的貢獻(xiàn)更多。因此,筆者認(rèn)為,DBA/2J小鼠由于fascin-2基因和Cdh23基因功能降低,導(dǎo)致其出現(xiàn)漸進(jìn)性的纖毛束的軟化和倒伏以及缺失,造成了小鼠聽力的早期受損。

綜上所述,本研究通過觀察2、4周齡及8周齡時(shí)DBA/2J小鼠毛細(xì)胞靜纖毛的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,觀察到纖毛束融合、軟化以及嚴(yán)重的倒伏甚至缺失等現(xiàn)象,筆者認(rèn)為這些形態(tài)學(xué)的改變是造成了DBA/2J小鼠的早發(fā)性聽力損害的重要因素。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Fetoni A R,Picciotti P M,Paludetti G,et al.Pathogenesis of presbycusis in animal models：a review[J].Exp Gerontol,2011,46(6)：413-425.

[2] 韓旭,葛汝麗,韓鋒產(chǎn).增齡性聾發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(13)：2227-2223.

[3] Shin J B,Longo-Guess C M,Gagnon L H,et al.The R109H variant of fascin-2,a developmentally regulated actin crosslinker in hair-cell stereocilia,underlies early-onset hearing loss of DBA/2J mice[J].J Neurosci,2010,30(29)：9683-9694.

[4] Perrin B J,Strandjord D M,Narayanan P,et al.Beta-actin and fascin-2 cooperate to maintain stereocilia length[J].J Neurosci,2013,33(19)：8114-8121.

[5] Men Y,Zhang A,Li H,et al.LKB1 is required for the development and maintenance of stereocilia in inner ear hair cells in mice[J].PLoS One,2015,10(8)：1371-1318.

[6] 孫建和,王秋菊,姜泗長(zhǎng).耳掃描電鏡圖譜[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2006：218-212.

[7] Bowl M R,Dawson S J.The mouse as a model for age-related hearing loss-a mini-review[J].Gerontology,2015,61：149-149.

[8] Yang L,Zhang H,Han X,et al.Attenuation of hearing loss in DBA/2J mice by anti-apoptotic treatment[J].Hear Res,2015,327：109-116.

[9] Johnson K R,Zheng Q Y,C L.A major gene affecting age-related hearing loss is common to at least ten inbred strains of mice[J].Biol Sci,2000,70：171-110.

[10] Fengchan H,Oumei W,Quanxiang C.Anti-apoptotic treatment in mouse models of age-related hearing loss[J].J Otol,2016,11(1)：7-12.

[11] 胡浩,鄔玲仟,梁德生,等.非綜合征型感音神經(jīng)性聾相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2005,40(8)：633-635.

[12] Palma F D,Holme R H,Bryda E C,et al.Mutations in Cdh23,encoding a new type of cadherin,cause stereocilia disorganization in waltzer,the mousemodel for Usher syndrome type 1D[J].Nat Genet,2001,27：103-105.

[13] Johnson K R,Erway L C,Cook S A,et al.A major gene affecting age-related hearing loss in C57BL/6J mice[J].Hear Res,1997,114(1-2)：83-92.

[14] 楊琳琳,宋西成,韓鋒產(chǎn).FSCN-2基因功能的研究進(jìn)展[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào),2015,29(6)：1-3.