瑞舒伐他汀對急性腦缺血再灌注大鼠腦含水量及海馬區(qū)MG的影響

馮 濤

目前臨床上最常見腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是急性腦梗死，其發(fā)病率占CVD約70%。近些年來隨著影像技術(shù)及神經(jīng)介入技術(shù)的廣泛應(yīng)用，急性腦梗死超早期血管再通、缺血再灌注對腦組織半暗帶區(qū)域(Ischemic Penumbra，IP)神經(jīng)元功能的恢復(fù)具有重要意義。腦缺血再灌注損傷也成為急性腦梗死后腦損傷常見病理過程。

腦缺血再灌注過程中，腦組織由缺血性改變轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖嘧ⅲX屏障的破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣超載及興奮性氨基酸(EAA)毒性作用，過度的免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織明顯發(fā)生毒性水腫、神經(jīng)元變性、功能喪失。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)是腦內(nèi)的主要免疫應(yīng)答細(xì)胞，對維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。當(dāng)腦內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時，MG快速活化激活，分泌大量神經(jīng)炎性因子，導(dǎo)致腦內(nèi)自身免疫反應(yīng)，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，加劇腦細(xì)胞水腫及神經(jīng)元的損傷。

他汀類藥物通過抑制三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)，具有降低VLDL-C與LDL-C，升高HDL-C的作用。近些年來更多的基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物具有獨立影響血脂減輕免疫炎癥反應(yīng)，抑制MG過度表達(dá)的多效性作用。目前有關(guān)他汀類藥物對MG表達(dá)影響研究較少，機(jī)制不完全清楚。本研究通過觀察急性腦缺血再灌注損傷后大鼠腦含水量、海馬區(qū)MG的表達(dá)和海馬區(qū)神經(jīng)元病理改變，以及給與瑞舒伐他汀干預(yù)后的變化，探討他汀類藥物腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 挑選雄性健康SD大鼠96只，清潔級，體重(210±20)g，鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心供。實驗SD大鼠在造MCAO模型前3 d帶回實驗室。避免刺激，實驗室溫度保持21～26 ℃，濕度適宜。自由進(jìn)食水。隨機(jī)將96只SD大鼠平均分正常大鼠為A組，假模型組為B組，模型組為C組，干預(yù)組為D組，每組分為24 h、72 h、7 d、14 d時間點，造模前禁食水。

1.1.2 藥物與試劑 大鼠MCAO栓線購于北京沙東生物技術(shù)有限公司 。Ox42(MG的標(biāo)志)抗體、SP9001試劑盒 、DAB試劑盒購于北京中杉生物工程公司 。多聚甲醛由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。磷酸二氫鈉由汕頭市光華化學(xué)廠提供。采用德國Lecia顯微照像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用日本奧林巴斯光學(xué)顯微鏡。瑞舒伐他汀鈣(瑞旨片，山東魯南貝特制藥有限公司)，規(guī)格：5 mg/片，生產(chǎn)批號：H20080240。

1.2 方法

1.2.1 制備大鼠MCAO模型 SD大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型采用改良Zea Longa[1，2]線栓法制備。實驗前大鼠被禁食12 h、禁水4 h。腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)進(jìn)行麻醉，備皮，消毒，鋪巾，左頸正中旁切口，切開皮膚，分離皮下、肌肉組織及迷走神經(jīng)。游離左頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)，頸內(nèi)動脈(ICA)，采用微型動脈夾夾閉CCA和ECA近心端，ECA遠(yuǎn)心端線扎，從ECA將線栓[線栓頭直徑(0.32±0.02) mm]插入ICA進(jìn)顱方推進(jìn)18～20 mm，到達(dá)大腦中動脈分叉處，放松微型動脈，局部縫合皮膚，外露栓線末端。2 h后線栓拔出4 mm行再灌注。

1.2.2 動物處理 正常大鼠組為雄性健康SD大鼠。假模型組大鼠僅在禁食12 h、禁水4 h、麻醉后切開皮膚，分離皮下組織后局部縫合皮膚。模型組即為MCAO大鼠，在造模型后給予生理鹽水2 ml灌胃。干預(yù)組是在MCAO后即給于瑞舒伐他汀鈣2 mg/kg(2 ml溶液)灌胃。各組大鼠實驗結(jié)束用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射深度麻醉，從左心室加壓生理鹽水灌洗、灌注4%多聚甲醛溶液固定，取腦，4%多聚甲醛液固定24 h，脫水，浸蠟，石蠟包埋，制石蠟冠狀切片(厚度4 μm)。

1.2.3 指標(biāo)檢測

1.2.3.1 腦含水量測定 應(yīng)用干濕重方法對大鼠腦含水量進(jìn)行測定，腦含水量(%)=(腦濕重-腦干重) /腦濕重×100%。

1.2.3.2 免疫組織化學(xué)染色(SP法)步驟 采用二甲苯對石蠟冠狀切片進(jìn)行脫蠟2次，酒精脫蠟2次，蒸餾水清洗2次，檸檬酸修復(fù)液高溫修復(fù)，低溫維持，室溫冷卻。采用3%H2O2去離子水孵育，PBS液沖洗后滴加山羊血清封閉液，采用內(nèi)源性生物素進(jìn)行封閉。滴加一抗OX42抗體(1∶100稀釋)4 ℃過夜。室溫復(fù)溫，PBS液沖洗，滴生物素二抗工作液，PBS液沖洗后滴辣根酶液，孵育，PBS液沖洗后滴加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染，水沖洗后混合液脫色，采用低到高濃度酒精脫水、封片。高倍鏡(×400)下對大鼠海馬區(qū)MG進(jìn)行觀測，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色染色改變，采集圖像，分析陽性區(qū)平均積分光密度值。

1.2.3.3 HE染色步驟 石蠟冠狀切片置烤箱30 min后脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、分化、返藍(lán)、復(fù)染、脫水、二級透明、封片，高倍鏡(×400)下對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行觀測。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦含水量改變結(jié)果 A、B各組四個時間點通過干濕重法測定腦含水量無明顯改變(P>0.05)，D、C組大鼠在MCAO后24 h時腦含水量開始升高，72 h明顯增加，7 d達(dá)到高峰，14 d明顯下降，與A、B組進(jìn)行比較分析，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，D組24 h、72 h腦含水量與C組進(jìn)行比較，腦含水量下降不明顯，差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，7 d與14 d腦含水量與C組進(jìn)行比較，腦含水量明顯降低，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，(見表1)。

2.2 大鼠海馬區(qū)MG(OX42)的表達(dá) A、B、C、D組大鼠各個時間點海馬區(qū)MG均有表達(dá)。A、B組四個時間點通過免疫組化法測定MG的表達(dá)差異不明顯(P>0.05)。D、C組大鼠在MCAO后24 h時MG表達(dá)開始增多，72 h表達(dá)增多明顯，7 d表達(dá)達(dá)到高峰，14 d表達(dá)下降明顯，與A、B組進(jìn)行分析比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。D組MG表達(dá)在4 h、72 h與C組分析比較，MG表達(dá)減少不明顯，差異明顯無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，MG表達(dá)在7 d與14 d與C組分析比較，MG表達(dá)減少明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，(見表2)。

2.3 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色結(jié)果 通過高倍鏡對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元觀察發(fā)現(xiàn)A、B組大鼠神經(jīng)元在鏡下未見明顯的神經(jīng)元變性壞死及空泡現(xiàn)象細(xì)。胞整齊排列，胞膜、胞核完整，胞漿清晰。C、D組大鼠神經(jīng)元在鏡下可見明顯的神經(jīng)元變性壞死及空泡現(xiàn)象。視野下細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，細(xì)胞排列及其不整齊，胞膜結(jié)構(gòu)不完整、胞核濃縮，出現(xiàn)渾濁的胞漿，可見大量的神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象。D組與C組相比，神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，神經(jīng)元變性程度及空泡現(xiàn)象明顯減輕(見圖1～圖4)。

表1 四組大鼠腦含水量比較

注：與C組相比*P>0.05；與C組相比**P<0.05

表2 四組大鼠海馬區(qū)OX42平均積分光密度值

注：與C組相比*P>0.05；與C組相比**P<0.05

圖1 A組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖2 B組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖3 C組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

圖4 D組海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色(×400)

3 討 論

急性腦梗死是臨床上最常見的腦血管疾病，其致死率、致殘率極高。腦內(nèi)氧與葡萄糖儲備量少，對缺血、缺氧敏感。完全中斷3～5 min血流即可導(dǎo)致腦神經(jīng)元不可逆損傷。已有資料研究發(fā)現(xiàn)[3]，在急性腦梗死早期梗死區(qū)與IP區(qū)基本相同；3～4.5 h后一半的IP區(qū)再次轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡婀Ｋ绤^(qū)；6～8 h后IP區(qū)消失，全部轉(zhuǎn)為不可逆梗死區(qū)[4]。因此及早開通腦內(nèi)閉塞的動脈，對改善腦缺血半暗帶(ischemic penumbra，IP)區(qū)域神經(jīng)元的功能非常重要[5]。腦缺血再灌注對神經(jīng)元也造成明顯的損傷，即腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷的病理生理基礎(chǔ)為炎癥反應(yīng)、氧自由基的大量生成、興奮性氨基酸(EAA)毒性、神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載、血腦屏障損傷、線粒體衰減、細(xì)胞抗凋亡基因及凋亡基因的失衡、腦水腫、小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化等[3]。其中炎癥反應(yīng)的標(biāo)志是小膠質(zhì)細(xì)胞激活[6]，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，加劇缺血區(qū)缺血缺氧，刺激更多的氧自由基及縮血管物質(zhì)生成等，加速缺血壞死區(qū)范圍[7]。因此控制腦缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活，可以保護(hù)神經(jīng)元，降低腦缺血再灌注損傷程度，成為臨床上治療缺血性腦血管病新的治療方法[8，9]。

他汀類藥物多效性是指除了其降脂作用外的作用，主要有減輕免疫炎癥反應(yīng)，抑制血管緊張素Ⅱ受體，減少血管內(nèi)皮素(ET)分泌，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶活性，并具有抑制血小板活化等作用。研究表明[10]他汀類藥物的多效性是其抑制膽固醇生物合成通路中間產(chǎn)物異戊二烯類的合成，上調(diào)一氧化氮合酶(eNOS)水平，提高一氧化氮(NO)活性，改變血管內(nèi)皮功能，減少核轉(zhuǎn)錄因子kB表達(dá)，降低炎癥因子C反應(yīng)蛋白的水平[11]，抗血管內(nèi)膜炎癥，穩(wěn)定及固定動脈粥樣硬化斑塊，是他汀類藥物廣泛應(yīng)用于臨床上治療心腦血管疾病治療病理生理的基礎(chǔ)。

他汀類藥物抗炎可能與其抑制P-selectin、細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、E-selectin等表達(dá)，下調(diào)內(nèi)皮素-1(endothelin-1)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin)，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)與炎性反應(yīng)因子激活等，抑制以 NF-κB 為核心炎癥反應(yīng)通路來發(fā)揮作用[12]。本實驗通過瑞舒伐他汀對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦含水量及海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀能明顯減輕急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦含水量，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元HE染色也表明瑞舒伐他汀干預(yù)后神經(jīng)元損傷明顯減輕，凋亡細(xì)胞及空泡明顯減輕，殘存神經(jīng)元數(shù)目比未經(jīng)瑞舒伐他汀干預(yù)的大鼠明顯增多。充分表明瑞舒伐他汀能明顯降低急性腦缺血再灌注損傷，具有腦保護(hù)作用。

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