熒光成像系統(tǒng)對比度分析與成像仿真

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(1.沈陽藥科大學(xué) 醫(yī)療器械學(xué)院, 遼寧 本溪 117004;2.沈陽儀表科學(xué)研究院有限公司, 遼寧 沈陽 110043)

引 言

熒光成像技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用,熒光顯微鏡是最早出現(xiàn)的一種熒光成像系統(tǒng),后續(xù)其他種類的熒光成像系統(tǒng)也逐漸產(chǎn)生并被采用[1]。熒光成像系統(tǒng)涉及許多設(shè)計(jì)環(huán)節(jié),比如當(dāng)觀測樣品更換不同熒光染料時(shí),或廠商升級開發(fā)新設(shè)備時(shí),往往需要參數(shù)論證和產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)好的成像效果[2-3]。以系統(tǒng)核心光學(xué)元件濾光片為例,開發(fā)新產(chǎn)品需經(jīng)過指標(biāo)評估、產(chǎn)品設(shè)計(jì)評審、膜系設(shè)計(jì)、樣品的試制、測試實(shí)驗(yàn)等環(huán)節(jié),開發(fā)周期較長[4]。此外,由于濾光片用途的差異,盡管波長范圍較為接近,但對于成像應(yīng)用領(lǐng)域來說指標(biāo)冗余,造成不必要的原料消耗和成本升高。最后,單獨(dú)從熒光染料和濾光片組的曲線匹配上判斷,很難直觀反映系統(tǒng)的觀察結(jié)果,系統(tǒng)廠商也很難提出非常準(zhǔn)確的參數(shù)要求來匹配新設(shè)備。這些原因?qū)е滦枰磸?fù)進(jìn)行樣品試制和驗(yàn)證,增加了研制周期。

綜上考慮,為了快速驗(yàn)證各模塊光譜參數(shù)是否匹配且能直觀反映系統(tǒng)成像效果,本文提出了熒光成像鏈路模型。通過該模型對系統(tǒng)成像對比度進(jìn)行了分析并得到了仿真成像效果,希望該仿真方法能對各類熒光系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和效果評價(jià)提供一定幫助和借鑒。

1 原 理

熒光成像系統(tǒng)包括光源、熒光染料、濾光片組、成像光路、CCD圖像采集等模塊。以熒光顯微鏡為例,與普通成像系統(tǒng)不同,濾光片在熒光系統(tǒng)中分離和選擇物質(zhì)的激發(fā)光與發(fā)射熒光的特征波段光譜,決定了圖像的背景與信號亮度及對比度[3]。因此,影響成像對比度和背景噪聲的核心器件是濾光片組。熒光物質(zhì)受到激發(fā)發(fā)射熒光的時(shí)間短暫,熒光的輻射強(qiáng)度相對于激發(fā)光源的反射光強(qiáng)度要微弱很多,通常僅為萬分之一的數(shù)量級[4-6]。本文忽略成像CCD的光譜響應(yīng)及噪聲對成像系統(tǒng)的影響,集中分析濾光片組及各模塊間匹配性對成像效果的影響。

熒光染料的熒光發(fā)射輻射強(qiáng)度不僅與物質(zhì)分子有關(guān),還與激發(fā)光的強(qiáng)度、染料濃度等因素有關(guān)。根據(jù)理論分析[7],熒光物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi),熒光強(qiáng)度可以表示為:

If=kI0

(1)

式中:I0為激發(fā)光的輻射強(qiáng)度;k為與染料消光系數(shù)、量子產(chǎn)率、濃度有關(guān)的系數(shù)。

成像系統(tǒng)的背景噪聲主要來自光源在光路的漫反射光、系統(tǒng)外部的環(huán)境光以及CCD成像器件的暗電流噪聲。熒光成像系統(tǒng)通常在暗室環(huán)境下操作,因此背景噪聲大小即背景光強(qiáng)度主要由光源的漫反射光決定。背景光的輻射強(qiáng)度表示為:

Ib=RI0

(2)

式中:R為光路中的漫反射率;I0為光源的輻射強(qiáng)度。通過前面分析可知,k/R應(yīng)具有10-4的數(shù)量級。

熒光成像系統(tǒng)的成像鏈路如圖1所示。

圖1 熒光成像系統(tǒng)成像鏈路Fig.1 Imaging chain of fluorescence imaging system

根據(jù)鏈路模型分析,光源通過熒光激發(fā)片,形成一定波段分布的激發(fā)光。每個(gè)波長的激發(fā)光都會激發(fā)出有特定光譜范圍的熒光。激發(fā)光的波長不同,熒光激發(fā)效率也發(fā)生變化。發(fā)射的熒光經(jīng)過發(fā)射片,通過成像光路最終進(jìn)入CCD成像器件。在可見光范圍內(nèi),CCD的光譜響應(yīng)曲線變化較為平緩,為了簡化模型,將CCD光譜響應(yīng)率在可見熒光發(fā)射帶寬內(nèi)都近似為100%。

綜上,熒光信號的歸一化強(qiáng)度可表示為:

(3)

式中:S(λi)為光源光譜歸一化輻射強(qiáng)度;Ex(λi)為濾光片組中的激發(fā)片光譜透過曲線函數(shù);Q(λi)為熒光染料歸一化激發(fā)效率也稱激發(fā)光譜;E(λn)為熒光染料歸一化發(fā)射效率也稱發(fā)射光譜;EM(λn)為熒光濾光片發(fā)射片光譜透過曲線函數(shù)。

激發(fā)光源部分反射光會透過發(fā)射片進(jìn)入CCD成像器件,形成背景光信號,即產(chǎn)生背景噪聲。最終的背景光信號強(qiáng)度可以表示為:

(4)

其中與反射光輻射強(qiáng)度有關(guān)的系數(shù)R取104,以保證各項(xiàng)歸一化參數(shù)計(jì)算的輻射強(qiáng)度數(shù)量級與式(1)、(2)相吻合。

如果已知光源、濾光片組的光譜曲線以及染料的激發(fā)和發(fā)射譜線,便可通過式(3)、(4)分別計(jì)算出系統(tǒng)后端接收的熒光染料發(fā)射的熒光信號強(qiáng)度和背景光強(qiáng)度。將計(jì)算得到的強(qiáng)度值進(jìn)行均勻量化,賦予圖像灰度值,最終可得到模擬的熒光圖像效果。

熒光成像背景較為均勻,采用Michelson對比度定義[8],分析熒光圖像的成像對比度特點(diǎn),對比度數(shù)值可表示為

(5)

式中:c為成像對比度;ΔI=(Imax-Imin)/2;I=Imin?？梢钥闯鯿是0到1之間的數(shù),可以轉(zhuǎn)換為百分比表示,其值越大,表明信號明暗差異越大,對比越明顯。從式(5)可以看出,若圖像亮度降低,對比度也相應(yīng)成比例下降。通過對比度特性可評價(jià)系統(tǒng)背景抑制程度,判別濾光片組、光源、染料之間的匹配程度,來指導(dǎo)后續(xù)系統(tǒng)設(shè)計(jì)。

2 仿真分析與結(jié)果討論

首先采用鏈路模型分析激發(fā)光源為激光的情況。由于激光光源單色性較好,成像系統(tǒng)可以不采用激發(fā)濾光片,后續(xù)成像效果主要由發(fā)射濾光片決定,模型計(jì)算較為簡單。模型中各模塊參數(shù)如下:激光器中心波長為435 nm,半波帶寬為2 nm;濾光片組型號為Chroma? 39001,發(fā)射濾光片透過光譜帶寬外平均的光密度值為6;熒光試劑為Cerulean。模擬的觀測目標(biāo)由不同的試劑濃度組成,由上到下的目標(biāo)分別為最大濃度、最大濃度的50%、25%和10%。各模塊之間的光譜參數(shù)匹配,根據(jù)各模塊的光譜曲線,采用式(3)、(4)計(jì)算信號及背景輻照強(qiáng)度。

根據(jù)前面的理論分析,染料濃度最大的目標(biāo)部位亮度最高,建立的其余目標(biāo)濃度分別遞減,亮度也隨之成比例降低。CCD的光圈和曝光時(shí)間設(shè)置通常以目標(biāo)高亮處作為參考,避免出現(xiàn)CCD像元過曝或曝光不足的情況。發(fā)射濾光片的真實(shí)OD值為6,其仿真結(jié)果如圖2(a)所示。假設(shè)發(fā)射濾光片在設(shè)計(jì)時(shí),激發(fā)光波長附近的OD值只有4,模擬該種情況下的成像效果。得到的仿真結(jié)果如圖2(b)所示。進(jìn)一步降低發(fā)射片光密度,使OD值降至3,該情況下的仿真圖像如圖2(c)所示。

當(dāng)發(fā)射濾光片的光密度值為6時(shí),進(jìn)入CCD的背景光強(qiáng)度很弱,背景噪聲得到了較好的抑制,通過式(5)計(jì)算,對比度c為99.79%。從圖2(a)可以看到,通過灰度均勻量化后,圖像背景灰度值為0,最大濃度處灰度值最高。此種情況下,CCD的灰度區(qū)間得到了充分的利用,濃度最大和濃度最小的目標(biāo)都可以被觀察到,灰度圖像層次分明。圖2(b)所對應(yīng)的濾光片光密度值為4,相對于前一種情況,更多的背景光能夠透過發(fā)射片進(jìn)入到CCD中。圖像的背景亮度增大,10%濃度的目標(biāo)已經(jīng)被背景光淹沒,此時(shí)背景噪聲已開始對成像產(chǎn)生影響,最亮處的目標(biāo)還清晰可見,計(jì)算得到高亮處對比度為80%。當(dāng)發(fā)射片的OD值降為3時(shí),大量的激發(fā)光進(jìn)入成像光路末端,背景亮度明顯增大。圖2(c)可以看到,觀測目標(biāo)信號光已完全被背景光所掩蓋,系統(tǒng)無法滿足工作狀態(tài)。仿真結(jié)果證明,OD值反映了背景信號的截止程度,而背景信號的強(qiáng)度是影響成像對比度效果的因素之一。將不同OD值對應(yīng)的成像對比度做成關(guān)系曲線,如圖3所示。

圖2 不同OD值下的仿真結(jié)果Fig.2 Simulated results under different OD conditions

圖3 對比度與OD關(guān)系曲線Fig.3 Relationship between contrast and OD

通過圖3的曲線關(guān)系可以發(fā)現(xiàn),濾光片光密度值在3～5之間時(shí),對比度變化趨勢明顯;當(dāng)OD值大于5后,對比度變化趨于平緩。從曲線關(guān)系可以看出,繼續(xù)增加濾光片OD值對于提高成像對比度已無明顯作用,反而會增加不必要的設(shè)計(jì)難度和制造周期。

背景信號截止深度的OD值大于5后,對比度隨著OD值增加逐漸平緩,所以成像用濾光片的設(shè)計(jì)OD值通常在5～7之間。而OD值大于7的濾光片對于微弱信號采集具有重要作用,因此往往用在對探測靈敏度要求更高的其他熒光檢測領(lǐng)域[9]。以上分析與實(shí)際產(chǎn)品設(shè)計(jì)和應(yīng)用是相吻合的,側(cè)面反映出該模型對于背景噪聲的仿真具有可行性。

當(dāng)前熒光成像系統(tǒng)的光源廣泛使用LED作為激發(fā)光源[10-11],為了能夠真實(shí)模擬熒光顯微鏡光源、染料、濾光片組的光譜參數(shù)匹配效果,并且能將仿真圖像與真實(shí)系統(tǒng)進(jìn)行對照,下面將LED激發(fā)光源光譜曲線導(dǎo)入模型作進(jìn)一步仿真驗(yàn)證。光源采用的是525 nm綠光LED,半寬40 nm,熒光染料及配套濾光片組的光譜曲線如圖4所示。

圖4 熒光試劑受激發(fā)射與濾光片的光譜Fig.4 The spectrum of fluorescence reagent excitation and fluorescence filter

通過各模塊歸一化光譜曲線,利用式(3)、(4),可模擬出參數(shù)匹配下系統(tǒng)的熒光成像效果,結(jié)果如圖5(a)所示。對于配套的濾光片組,光源、濾光片、熒光染料的光譜曲線匹配較好,能夠保證較高的激發(fā)光效率和熒光發(fā)射強(qiáng)度,圖像具有良好的亮度和對比度。濾光片組在膜系設(shè)計(jì)時(shí),均會考慮激發(fā)片與發(fā)射片兩者的背景交叉點(diǎn)的OD值在6左右,即保證背景的截止深度[2],而往往難以把握的是濾光片組與染料試劑的相互匹配。為了驗(yàn)證濾光片與染料試劑未良好匹配的影響,將濾光片的發(fā)射片中心波長由617 nm替換為677 nm,帶寬仍為55 nm,模擬該情況下的成像效果,仿真結(jié)果如圖5(b)所示。與替換前相比,兩組的激發(fā)片和發(fā)射片的背景交叉點(diǎn)均滿足OD值在6以上,但是發(fā)射片與染料發(fā)射光譜未完全匹配。

通過圖6仿真結(jié)果看到,兩種情況的背景噪聲都得到了較好的抑制,但圖像整體亮度發(fā)生了變化。這是由于發(fā)射片向長波方向移動后,透過光譜偏離了染料的熒光發(fā)射峰,進(jìn)入到CCD的目標(biāo)信號強(qiáng)度降低。CCD將接收的熒光信號均勻量化后,圖像并未充分利用量化的灰度范圍,這是因?yàn)閳D像亮度降低,灰度區(qū)間被壓縮。這導(dǎo)致圖像的灰度層次不再豐富,圖像不利于觀察,圖像對比度會成相應(yīng)比例下降[12],并且低亮度目標(biāo)即低濃度區(qū)域的細(xì)節(jié)也會丟失。由此可以發(fā)現(xiàn),熒光圖像的對比度不僅和背景強(qiáng)度的抑制程度有關(guān),還與各模塊的參數(shù)是否匹配息息相關(guān)。

為驗(yàn)證仿真圖像的可信度,使用熒光顯微鏡對上述濾光片組進(jìn)行了實(shí)際測試。測試前準(zhǔn)備了兩套濾光片組,一組光譜曲線參數(shù)匹配較好,另一組發(fā)射片中心波長向長波偏移60 nm。圖6展示了依次替換兩組濾光片,分別采集到的組織樣本圖像。圖6(a)為采用與光源和染料匹配的濾光片組,完整呈現(xiàn)了組織輪廓;圖6(b)則采用了另一組匹配性不好的濾光片組,組織邊緣低染色濃度的區(qū)域細(xì)節(jié)丟失。對比可知,測試中發(fā)射片與熒光試劑的發(fā)射光譜不完全匹配,會造成CCD采集熒光圖像信號衰弱和對比度下降,組織邊緣的細(xì)節(jié)消失。實(shí)際系統(tǒng)成像的效果與仿真結(jié)果相吻合,證明了該鏈路模型仿真方法的正確性和有效性。

圖5 熒光成像系統(tǒng)仿真圖像Fig.5 Simulated images of fluorescence imaging systems

圖6 熒光顯微鏡采集真實(shí)圖像Fig.6 Images obtained by the fluorescence microscopy

3 結(jié) 論

熒光成像系統(tǒng)的設(shè)計(jì)涉及多個(gè)模塊,為了縮短產(chǎn)品設(shè)計(jì)周期并驗(yàn)證各模塊參數(shù)匹配度,且能更直觀地反映系統(tǒng)的成像效果,本文提出了熒光成像鏈路模型。利用該鏈路模型,對熒光成像過程進(jìn)行了分析與仿真,驗(yàn)證了濾光片OD值這一影響對比度主要因素,結(jié)論與熒光濾光片設(shè)計(jì)思路相吻合。另外,熒光成像系統(tǒng)各模塊是否良好匹配,也會對圖像的對比度和亮度產(chǎn)生影響。本文最后從熒光顯微系統(tǒng)入手,通過模型直觀仿真了模塊不匹配對圖像效果的影響,仿真結(jié)果與實(shí)際成像效果一致,證明該鏈路模型仿真的可行性和有效性。

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