白細胞介素25在哮喘小鼠肺組織中的表達及其對氣道重塑的影響*

胡建平，韓俊壘，湯兵祥

(河南省胸科醫(yī)院呼吸一病區(qū)，鄭州 450008)

支氣管哮喘是全球重點關注的異質性疾病之一，嚴重危害公眾健康，主要表現(xiàn)為氣道慢性炎癥。哮喘發(fā)病機制及防治方法是目前臨床醫(yī)學急需解決的難題[1-2]。氣道重塑作為一種重要的哮喘性氣道改變，上皮肥厚及化生、肌層纖維細胞增殖，杯狀細胞增生，新生血管形成，基底膜下細胞外基質沉積，氣道平滑肌的細胞增生等是其主要特點；若發(fā)生氣道重塑，可導致哮喘轉變?yōu)橄?慢阻肺重疊綜合征[3-4]。氣道上皮細胞在受到病原微生物、過敏原刺激后能分泌出多種細胞因子，此細胞因子在哮喘免疫應答、調控方面具有重要意義，其中白細胞介素(IL)-25是近年來醫(yī)學研究熱點[5]。IL-25是IL-17細胞因子的家族成員之一，能啟動、調節(jié)Th2細胞，促進Th2型免疫應答[6]。研究顯示，哮喘患者、小鼠哮喘模型的血清及痰液、肺組織內均存在高表達IL-25，基因過表達、外源性給予IL-25可導致小鼠產(chǎn)生氣道高反應性等類似人類哮喘樣改變[7]。平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是一種重要的平滑肌標志物，膠原合成能力較強，具有一定收縮潛能，能對平滑肌收縮功能改變、數(shù)量進行反映，能引起官腔收縮狹窄和哮喘發(fā)作，故α-SMA表達增加可能和哮喘氣道重塑、發(fā)作等具有密切關聯(lián)[8-9]。本研究為準確識別哮喘內表型差異，增強哮喘治療效果，對哮喘小鼠肺組織內IL-25表達及IL-25對氣道重塑的影響進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取鄭州大學基礎醫(yī)學院飼養(yǎng)的90只雌性BALB/C小鼠作為實驗對象，約8周齡，體質量19～28 g。所有小鼠均飼養(yǎng)在具有空氣過濾的21～22 ℃恒溫房間，每間隔12 h實施1次光暗循環(huán)。實驗開展前小鼠自由飲水與攝食，鼠糧均接受輻照消毒，飲用水為高溫消毒的純凈水。本研究通過單位動物倫理委員會批準[201609-005]。

1.2方法

1.2.1構建小鼠哮喘模型 (1)90只小鼠分為對照組、實驗組各45只，并隨機編號。(2)造模期間飲用水、鼠糧間隔2～3 d更換1次，鼠籠及墊料每周更換1次。(3)配制雞卵清蛋白(OVA)混懸液、霧化液：分別稱取適量的OVA、氫氧化鋁，在0.25 mL無菌生理鹽水內溶入OVA 100 mg，氫氧化鋁1 mg，制備為OVA混懸液，于60 min內用完；再于1 mL生理鹽水內溶入25 mg的OVA，攪拌均勻，配制成OVA(2.5%)生理鹽水溶液，霧化為氣溶膠后，可供小鼠吸入。(4)小鼠造模：①小鼠致敏，依據(jù)現(xiàn)配現(xiàn)用原則配制OVA混懸液，將100 mg的OVA、氫氧化鋁1 mg溶于0.25 mL無菌生理鹽水內配制為致敏液體。②小鼠飼養(yǎng)第1天行致敏處理，將0.2 mL致敏溶液從腹腔注入小鼠體內；對照組每只小鼠均經(jīng)腹腔注入生理鹽水0.2 mL。③飼養(yǎng)第8天再行致敏處理，將0.2 mL致敏溶液從腹腔注入小鼠體內；對照組每只小鼠由腹腔注入生理鹽水0.2 mL。④飼養(yǎng)1～8 d，兩組小鼠均不接受任何處理，第8天致敏結束后至第15天期間不行任何處理，定期更換飲用水、鼠糧、墊糧及鼠籠。⑤飼養(yǎng)小鼠2周后，取出小鼠放進霧化盒內，實施小鼠霧化，每次抽取霧化液20 mL放進霧化裝置內，啟動980超聲霧化器，實驗組霧化吸入2.5%的OVA，30分鐘/次，持續(xù)霧化7 d；對照組霧化吸入0.9%生理鹽水，30分鐘/次，持續(xù)霧化7 d。⑥霧化完成后，于24 h內處死小鼠。

1.2.2提取小鼠肺、支氣管組織 (1)根據(jù)每只小鼠體質量給予注射水合氯醛麻醉，每10 g注射0.25 mL。(2)所有實驗器材均經(jīng)高壓消毒無菌處理，取出小鼠1只眼睛，由內眥靜脈取血，放入EP管(1.5 mL)內，標記編號；取完血后，用針頭將小鼠頭部、四肢固定，將細線套在小鼠牙齒上固定頭部。(3)后用鑷子、組織剪將小鼠頸部皮膚剪開，將胸部、腹部皮膚剝離，使胸部、腹部組織與肌肉暴露；逐層剪開頸部組織至頸部主支氣管、支氣管周圍筋膜組織分離、暴露。用組織剪將小鼠胸骨、周圍組織去除，將小鼠胸腔剪開，暴露肺臟。(4)由主支氣管進留置針，經(jīng)留置針將0.9%生理鹽水注入小鼠肺組織內至兩肺膨脹；靜置一段時間，回收肺內液體，放進EP管(1.5 mL)內；取出肺泡灌洗液，將小鼠的肺組織與主支氣管分離并取出，用錫箔紙做好包裝。(5)小鼠腹腔用組織剪打開并分離腹部臟器，鑷子取出脾臟，放進甲醛冷凍管內，標記編號，放進-80 ℃冰箱內保存；解剖小鼠后對小鼠尸體進行適當處理。(6)小鼠血清、肺泡灌洗液放進-80 ℃冰箱內保存，肺氣管組織、脾臟組織放進液氮罐內保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測兩組小鼠血清、肺泡灌洗液內IL-25、α-SMA，所有操作嚴格根據(jù)說明書執(zhí)行。

1.2.3蛋白質印跡法 將制冰機開啟，在10 mL離心管上分別標記對照組、實驗組。由液氮罐內取出兩組小鼠的肺臟組織并放進冰塊內，量取每只小鼠組織各200 g，分別置入10 mL的離心管內，并將離心管置入冰塊內，參照10∶1比例配制放射免疫沉淀法(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)組織裂解液。在每組EP管內各加入組織裂解液100 mL，間斷振蕩。啟動勻漿機，蒸餾水沖洗勻漿機勻漿頭、勻漿組織，每個樣品勻漿完均用蒸餾水沖洗勻漿頭，勻漿后放進冰塊內。在4 ℃離心機內行12 000 r/min離心5 min。分別留取上清液放進新EP管內，放入-80 ℃冰箱內保存待用。用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測提取的肺臟蛋白質濃度，操作步驟嚴格按照試劑盒說明執(zhí)行。配制5%脫脂奶，步驟為選取玻璃板，清洗、調整玻璃板，配膠，配制電泳液，加入提取蛋白質、預染蛋白Marker，電泳，轉膜，洗膜，封閉，TBST清洗，加入IL-25抗體與內參，TBST清洗，二抗孵育，顯影。

1.2.4免疫組織化學法 (1)制作切片：剪取肺組織塊約0.5 cm3，常規(guī)漂洗、固定、乙醇梯度洗脫，用二甲苯相關溶液浸洗肺及支氣管組織，包裝、切片、展片，充分展平后放在涂抹蛋白甘油的載玻片上，于38 ℃恒溫箱內烘干，再染色。(2)免疫組織化學檢測：①將兩組小鼠肺組織放進60 ℃恒溫箱內烘烤，1 h后從烤箱內取出載玻片于室溫下冷卻。②將肺組織切片放進二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3內各脫蠟10 min；取出載玻片依次放進100%、95%、90%、80%、70%乙醇內脫洗，各5 min，用蒸餾水漂洗5 min。③修復抗原：將組織切片放進500 mL的0.01 mmol/L檸檬酸鹽溶液內，微波高溫加熱至沸騰，12 min后停止加熱，自然冷卻至室溫；用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，5分鐘/次。在組織切片上各滴加1滴3%的H2O2后放進濕盒內浸泡10 min，將內源性過氧化物酶消除。取出載玻片，用PBS漂洗3次，3分鐘/次。④封閉：在組織切片上滴加非免疫性動物血清50 mL，放進濕盒內封閉10 min，后取出載玻片用PBS緩沖液浸洗3次，3分鐘/次。⑤一抗孵育：根據(jù)1∶200比例將IL-25稀釋，在組織切片上滴加一抗，4 ℃冰箱內過夜。⑥復溫：第2天從冰箱內取出載玻片，自然復溫到室溫，用PBS浸洗3次，5分鐘/次。⑦二抗孵育：在各個組織切片上滴加1滴約50 mL二抗，放進37 ℃恒溫箱內孵育30 min，后放進濕盒內浸泡10 min；用PBS緩沖液浸洗3次，3分鐘/次。⑧顯色：在1 mL的DAB染色液底物緩沖液內加入1滴DAB濃縮液進行稀釋，配制成DAB工作液，避光下使用；在組織切片上滴加50 mL稀釋后的DAB溶液，對染色時間進行嚴格控制，后用自來水漂洗；DAB染色后的組織切片用蘇木精-伊紅(HE)染色1 min，染色后用自來水清洗1 min。⑨脫水：切片洗凈后實施乙醇梯度脫水及二甲苯脫水，具體操作說明脫蠟步驟相反，脫水后蓋蓋玻片，對蓋玻片方向進行校正，切片封好后放進恒溫箱內干燥。干燥后擦凈切片上殘余浮色，將標簽貼在玻片左端，注明組織切片的名稱、染色方法與日期、固定方法。于顯微鏡下對HE染色后的兩組小鼠組織切片進行觀察。

1.2.5RT-PCR檢測 采用TaKaRa公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取肺組織總RNA，定量后依照反轉錄試劑盒說明書嚴格操作制備cDNA。利用上海生物工程公司合成引物，采用SYBR Green法定量檢測IL-25 mRNA表達水平。其中，引物序列，上游5′-TGGACAGGACTTGAATCGG-3′，下游5′-CAGGAGTATGGCTTCCAGGGT-3′；GAPDH引物序列，上游5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′，下游5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGZTC-3′。將cDNA、引物和SYBR Green混合，分別在95 ℃、5 min，95℃、20 s，55 ℃、20 s，75 ℃、30 s，進行40 個循環(huán)。IL-25 mRNA表達水平采用相對定量法計算，用管家基因校正樣品初始量。

1.2.6觀察指標 結果判定：細胞質呈紅色，細胞核呈藍色，背景呈粉紅色，提示染色合格[10]。于400倍顯微鏡下觀察，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對肺組織切片上α-SMA氣道平滑肌厚度進行直接測量與分析，分析IL-25、α-SMA對氣道重塑的影響。

表1 兩組IL-25、IL-25 mRNA、α-SMA水平比較

2 結 果

2.1ELISA結果 對照組小鼠血清、肺泡灌洗液內IL-25、α-SMA水平均低于實驗組，肺組織內IL-25 mRNA也低于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2小鼠哮喘模型鑒定結果 實驗組小鼠在受到激發(fā)10 min后呼吸變快、加深，軀干、頭部、鼻子及面部皮膚均產(chǎn)生不同程度的瘙癢；早期發(fā)生躁動癥狀，后期出現(xiàn)弓背、點頭呼吸、呼吸急促、口唇發(fā)紫、前肢縮抬及少動等癥狀；嚴重小鼠發(fā)生大小便失禁、腹肌/肢體抽搐、呼吸減慢及反應遲緩等情況；小鼠在受到多次連續(xù)激發(fā)后，進食量縮減，體質量相對減輕，提示成功制備哮喘模型。對照組小鼠未產(chǎn)生上述癥狀。

圖1 對照組肺組織IL-25表達(×200) 圖2 實驗組肺組織IL-25表達(×200)

圖3 對照組α-SMA蛋白表達(×200) 圖4 實驗組α-SMA蛋白表達(×200)

2.3免疫組織化學法檢測結果 對照組小鼠的肺組織病理切片表明小鼠具有完整的支氣管黏膜上皮與肌層，管腔規(guī)則，支氣管組織與結構清晰、完整，組織周圍未出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤，黏液分泌表現(xiàn)正常(圖1)；實驗組小鼠支氣管的管壁增厚，黏膜上皮破損，管腔變狹窄，產(chǎn)生炎性細胞浸潤(圖2)。α-SMA蛋白的陽性表達主要在支氣管壁，支氣管壁上沉積棕褐色顆粒；實驗組小鼠支氣管壁上的α-SMA蛋白表達明顯高于對照組，見圖3～4。

2.4蛋白質印跡法結果 與對照組相比，實驗組小鼠支氣管肺組織內IL-25、α-SMA水平相對較高(P<0.05)，見圖5。

1：對照組，2～5：實驗組

圖5兩組小鼠蛋白質印跡法檢測結果

2.5相關性 實驗組小鼠肺組織內IL-25、α-SMA相關性表達呈正相關(r=0.751，P<0.05)。

3 討 論

相關研究指出支氣管哮喘的重要機制為Th1、Th2細胞比例失衡造成的免疫學改變，細胞因子分泌增多、Th2細胞數(shù)目增多、免疫反應功能亢進是其主要特點[11-13]。IL-25主要是由炎性細胞產(chǎn)生，是誘導支氣管哮喘氣道產(chǎn)生炎癥的重要中心介質[14]。根據(jù)嗜酸性粒細胞引起的哮喘發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細胞能誘導炎性細胞(肥大細胞)釋放組胺，釋放的組胺能導致支氣管平滑肌細胞肥大、支氣管基底膜的網(wǎng)狀組織增厚[15]。而Th2細胞在受到IL-25誘導后能釋放多種作用于不同細胞的趨化因子與細胞因子，并產(chǎn)生不同的生物學效應，引發(fā)哮喘氣道炎癥，故預測IL-25在哮喘氣道重塑中可能發(fā)揮重要作用[16-17]。另有相關研究表明，α-SMA及膠原蛋白-1、E-鈣粘蛋白大量沉積在支氣管哮喘氣道黏膜下，與氣道重塑發(fā)生存在一定相關性；α-SMA表達增加使痙攣、狹窄加重，增加黏液分泌物，進而引起抗透明質等酸酶反應，可能和哮喘癥狀發(fā)作、氣道重塑有關[17-19]。因此對哮喘患者肺組織內IL-25、IL-25 mRNA、α-SMA表達進行早期檢測，能為臨床防治哮喘提供新的參考依據(jù)。

李鴻佳等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IL-25在哮喘患者氣道內表達增加，能使上皮細胞、成纖維細胞上相應表達增加，提示IL-25與哮喘氣道重塑存在密切關聯(lián)。本研究結果說明IL-25在哮喘小鼠肺組織內表達水平較高，在哮喘病發(fā)過程中能經(jīng)一定相關機制引起氣道重塑，IL-25表達增加與哮喘氣道重塑存在一定相關性，故在哮喘氣道重塑發(fā)生、發(fā)展過程中IL-25可能起到重要作用。本研究與李鴻佳等[20]研究結果相對一致。

綜上所述，哮喘小鼠肺組織、血清及肺泡灌洗液內IL-25、α-SMA均呈相對高表達，根據(jù)IL-25、α-SMA正相關性，預測干預IL-25、下游因子表達，將相關通路、機制阻斷，能延緩或抑制氣道重塑，從而減輕哮喘臨床癥狀。

參考文獻

[1]扶紅根，雷后興．白介素-35與支氣管哮喘的相關性研究進展[J]．中國免疫學雜志，2016，32(1)：123-126．

[2]張夢瑩，徐蕓蕓，吳靜，等．哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達的關系[J]．江蘇大學學報(醫(yī)學版)，2015，26(4)：277-281．

[3]張元元，邊翠霞，吳金香，等．IL-33通過ERK1/2信號通路促進哮喘模型小鼠氣道重塑[J]．細胞與分子免疫學雜志，2016，32(5)：590-594．

[4]郭東霖，趙生濤，王熠杰，等．哮喘氣道重塑小鼠模型的構建及病理學特征變化的探討[J]．第三軍醫(yī)大學學報，2016，38(10)：1102-1106．

[5]NADER M A.Inhibition of airway inflammation and remodeling by sitagliptin in murine chronic asthma[J].Int Immunopharmacol,2015,29(2):761-769.

[6]劉清發(fā)，王超，孫啟晶，等．IL-25通過nuocyte細胞誘導哮喘小鼠氣道重塑[J]．山東大學學報(醫(yī)學版)，2016，54(8)：28-33．

[7]郭紅，成煥吉，魯繼榮，等．白細胞介素-25與支氣管哮喘小鼠發(fā)病的關系[J]．中國實驗診斷學，2013，17(8)：1387-1391．

[8]黃曉奇．HMGB1和α-SMA在BPD新生兒血清、肺泡灌洗液中的表達及臨床價值研究[J]．中國婦幼保健，2016，31(12)：2499-2500．

[9]XIN Y,LV J Q,WANG Y Z,et al.Effect of all-trans retinoic acids (ATRA) on the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in the lung tissues of rats with pulmonary arterial hypertension (PAH)[J].Genet Mol Res,2015,14(4):14308-14313.

[10]姚麗，宋麗敏．IL-25和TSLP在支氣管哮喘患兒外周血中的變化及其臨床意義[J]．臨床肺科雜志，2016，21(6)：1134-1136．

[11]閻昱升，湯渝玲．支氣管哮喘患者血清IL-37、IL-25、IgE的變化及意義[J]．醫(yī)學臨床研究，2015，32(5)：1014-1016．

[12]汪沛，徐蓓，任麗芬，等．IL-25對氣道平滑肌細胞增殖活性的影響及其機制[J]．國際呼吸雜志，2015，35(13)：1000-1003．

[13]IINUMA T,OKAMOTO Y,YAMAMOTO H,et al.Interleukin-25 and mucosal T cells in noneosinophilic and eosinophilic chronic rhinosinusitis[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2015,114(4):289-298.

[14]陸韋，劉清亮，冉豐豐，等．動態(tài)研究地塞米松對哮喘小鼠肺IL-25 mRNA和IL-25表達的影響[J]．醫(yī)學研究生學報，2013，26(10)：1032-1036．

[15]CHENG D,XUE Z,YI L L,et al.Epithelial interleukin-25 is a key mediator in Th2-high,corticosteroid-responsive asthma[J].Am J Respir Crit Care Med,2014,190(6):639-648.

[16]KOUZAKI H,TOJIMA I,KITA H,et al.Transcription of interleukin-25 and extracellular release of the protein is regulated by allergen proteases in airway epithelial cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013,49(5):741-750.

[17]WANG W B,YEN M L,LIU K J,et al.Interleukin-25 mediates transcriptional control of PD-L1 via STAT3 in multipotent human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to suppress Th17 responses[J].Stem Cell Reports,2015,5(3):392-404.

[18]LUO C T,LIU Q H,et al.Impaired bronchoprotection is not induced by increased smooth muscle mass in chronic treatment in vivo with formoterol in asthmatic mouse model[J].West In Med J,2014,63(6):641-646.

[19]HUANG K,YAN Z Q,ZHAO D,et al.SIRT1 and FOXO mediate contractile differentiation of vascular smooth muscle cells under cyclic stretch[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(5):1817-1829.

[20]李鴻佳，劉粉，魯?shù)芦\，等．IL-25在支氣管哮喘患者氣道炎癥中的表達及臨床意義[J]．中華全科醫(yī)師雜志，2013，12(11)：913-915．