結(jié)直腸癌HER2及Ki-67表達(dá)的關(guān)系及預(yù)后因素分析*

孫旭凌，申 婧，黃桂林，李豫江，李志剛△

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.普外二科;2.神經(jīng)內(nèi)科，新疆石河子 832008)

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。從2000年到2011年，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率及年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率顯著上升[1]。人表皮生長因子受體 2(HER2)是人類原癌基因之一，對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和生存有著重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞增殖核抗原(Ki-67)是具有代表性的增殖抗原之一，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究通過比較結(jié)直腸癌患者中HER2和Ki-67的表達(dá)情況，觀察其與臨床病理特征的關(guān)系，探討二者的相關(guān)性及對預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1-12月本院結(jié)直腸癌患者石蠟病理標(biāo)本71例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過化療，其中有5例術(shù)前肝轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移?；颊咧心?3例，女38例；年齡34～79歲，中位年齡62歲；右半結(jié)腸癌11例，橫結(jié)腸2例，左半結(jié)腸癌18例，直腸癌39例，多發(fā)癌(降結(jié)腸+低位直腸癌)1例；高分化5例，中分化56例，低分化10例；T1期3例，T2期23例，T3期22例，T4期23例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例(12例N1，12例N2)；Ⅰ期19例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。同時(shí)選擇30例距腫瘤大于5 cm的癌旁正常組織作為對照。

1.2方法

1.2.1試劑與方法 兔抗人HER2單克隆抗體和鼠抗人Ki-67單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，標(biāo)本切片，脫蠟、水化，經(jīng)0.3%H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶后，再高壓抗原修復(fù)，一抗、二抗、三抗作用后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2結(jié)果判定 由兩名高級職稱醫(yī)師進(jìn)行讀片。Ki-67以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，HER2陽性表達(dá)以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)。(1)HER2參照美國臨床腫瘤協(xié)會提出的HER2檢測指南[2]。(-)：腫瘤細(xì)胞沒有染色或少于10%細(xì)胞膜染色；(+)： >10%細(xì)胞有不完整的胞膜染色；(2+)：>10%細(xì)胞有完整的但較弱的胞膜染色；(3+)：>30%細(xì)胞有完整的較強(qiáng)的胞膜染色。(2)Ki-67按陽性細(xì)胞所占比例數(shù)分類如下。(-)： ≤10%， (+)：11%～24%，(2+)：>24%～50%，(3+)：>50%。上述結(jié)果(-)歸為陰性表達(dá)組，(+)、(2+)、(3+)歸為陽性表達(dá)組。本研究71例結(jié)直腸癌組織中Ki-67陽性表達(dá)率高，從5%到95%，不服從正態(tài)分布，中位數(shù)75%，以此將Ki-67分為高表達(dá)、低表達(dá)組。

1.2.3隨訪 術(shù)后采用電話及入戶方式進(jìn)行隨訪，起點(diǎn)為手術(shù)日，終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、失訪或至截止時(shí)間(2015年12月30日)，隨訪結(jié)束時(shí)，獲得完整隨訪資料69例，隨訪率為97.1%。18例患者死亡，其中15例死于癌轉(zhuǎn)移，2例死于心梗，1例死于肝硬化。術(shù)前肝轉(zhuǎn)移的4例患者中3例死亡，1例帶瘤生存。術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者有9例，其中5例肝轉(zhuǎn)移，3例肺轉(zhuǎn)移，1例骨轉(zhuǎn)移。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，生存分析采用Kaplan-Meier和Longrank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HER2、Ki-67在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達(dá) HER2結(jié)直腸癌組織陽性表達(dá)率為32.4%(23/71)，高于癌旁組織的10.0%(3/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.533，P=0.019)。Ki-67在結(jié)直腸癌組織陽性表達(dá)率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7% (2/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.437，P=0.001)，見圖1、2。

圖1 HER2在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)(×400)

2.2HER2、Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及兩者相關(guān)性 71例結(jié)直腸癌組織中，HER2陽性表達(dá)與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。Ki-67表達(dá)與腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度無關(guān)(P>0.05)，見表1。HER2、Ki-67在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.515，P=0.001)。

圖2 Ki-67在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)(×400)

2.3HER2、Ki-67的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者術(shù)后5年無病生存率、5年生存率的關(guān)系 HER2陽性患者和陰性患者術(shù)后5年無病生存率分別為48.4%、80.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.932，P<0.05)；Ki-67高表達(dá)患者和低表達(dá)患者術(shù)后5年無病生存率分別為56.5%、85.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.747，P<0.05)。

HER2陽性患者和陰性患者術(shù)后5年生存率分別為60.9%、80.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.762，P<0.05)；Ki-67高表達(dá)患者和低表達(dá)患者術(shù)后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.020，P<0.05)。

單因素分析顯示，腫瘤分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目、TNM分期、HER2和 Ki-67表達(dá)情況與患者的預(yù)后均有關(guān)(P<0.05)，見表2、圖3～6。

表1 HER2、 Ki-67的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

圖4 HER2陽性患者5年生存曲線

圖5 Ki-67陽性患者5年無病生存曲線表2 結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析結(jié)果

臨床病理特征n生存率(%)χ2P性別0.1650.684 男3372.1 女3876.3年齡(歲)1.9310.165 <603065.6

2.4Cox模型分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素 Cox 多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、浸潤深度為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響因素的Cox多因素回歸分析結(jié)果

圖6 Ki-67陽性患者5年生存曲線

3 討 論

HER2是癌基因erbB2的編碼產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量約為185 KU，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，屬于表皮生長因子受體家族的成員，HER2在腸癌中的臨床意義尚存在爭議。本研究結(jié)果顯示，HER2結(jié)直腸癌組織陽性表達(dá)率為32.4%(23/71)，高于癌旁組織的10.0%(3/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的陽性率低于張凱等[3]研究報(bào)道的62.5%(35/56)，而高于呂洋等[4]、KOUNTOURAKIS等[5]研究報(bào)道的陽性率(不到5%)。之所以報(bào)道的比例有差異，可能原因如下：(1)有的學(xué)者把HER2膜表達(dá)蛋白標(biāo)準(zhǔn)加上了細(xì)胞質(zhì)陽性表達(dá)后導(dǎo)致比例過高；(2)由于樣本量的不同及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)和方法的差異所造成的。本研究顯示HER2陽性表達(dá)與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM有關(guān)，HER2陽性組5年無病生存率、5年生存率均低于陰性組，與王瓊等[6]研究結(jié)果相似，該研究報(bào)道HER2陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。鄧巍等[7]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌HER2過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的分化程度及病理分期密切相關(guān)，HER2過表達(dá)患者的10年生存率明顯降低。分析本課題結(jié)果，HER2過表達(dá)的結(jié)直腸癌侵襲力增強(qiáng)、生存率降低的原因，可能與HER2能通過啟動(dòng)多種轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制而增加轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，包括細(xì)胞遷移率、體外侵襲力、Ⅳ型膠原酶活性，影響?zhàn)じ椒肿尤缟掀ぜ?xì)胞鈣黏蛋白合成等,進(jìn)而刺激癌細(xì)胞增長，侵襲性增加，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相對較快[8-9]。

Ki-67是具有代表性、應(yīng)用廣泛的增殖抗原之一，在細(xì)胞周期各期中，其表達(dá)受到高度準(zhǔn)確的調(diào)控，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[10]。OKIMURA等[11]研究發(fā)現(xiàn)Ki-67與細(xì)胞黏附分子CD44s、CD44v6等在胰腺乳突黏液腺癌及相關(guān)浸潤性癌中的表達(dá)具有相關(guān)性。本課題結(jié)果顯示Ki-67在結(jié)直腸癌組織陽性表達(dá)率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7%(2/30)，71例結(jié)直腸癌組織中Ki-67陽性表達(dá)率極高，從5.0%到95.0%，且不服從正態(tài)分布，中位數(shù)75.0%，以此將Ki-67分為高表達(dá)、低表達(dá)組，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān).這與劉萍等[12]、馬海龍等[13]研究結(jié)果類似，證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量越多、浸潤程度越深，Ki-67的陽性率越高。張曉雨等[14]研究顯示Ki-67陽性表達(dá)率為90.9%，Ki-67平均值為(37.47±25.14)%，以此為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組，支持此觀點(diǎn)的還有史漢蒙等[15]學(xué)者，此結(jié)果和本研究一致。在本研究中，Ki-67高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究證實(shí)HER2與Ki-67呈正相關(guān)，共同促進(jìn)腫瘤生長，究其原因，與兩者的作用機(jī)制密不可分，當(dāng)HER2蛋白過表達(dá)時(shí)，HER2異源二聚體形成數(shù)目增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶蛋白活化，發(fā)生酪氨酸自身磷酸化，激活多種信號傳導(dǎo)途徑，如磷脂酶C(PLC)、Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，引發(fā)瀑布式連鎖反應(yīng)，信號傳導(dǎo)經(jīng)細(xì)胞膜、細(xì)胞間質(zhì)至細(xì)胞核，進(jìn)而激活基因、促進(jìn)Ki-67的活化，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖，調(diào)控細(xì)胞周期引起腫瘤的迅速生長。目前HER2和Ki-67在乳腺癌有重要作用，Ki-67的14.0%值是乳腺癌基因分型的重要臨界值[16]，針對HER2的生物靶向治療已成為個(gè)體化治療的首選方案。而現(xiàn)在對于HER2在結(jié)直腸癌中的重要性也逐步得到專家認(rèn)為，有報(bào)道顯示結(jié)直腸癌HER2也與抗EGFR治療的耐藥相關(guān)，約5%的K-ras野生型晚期結(jié)直腸癌患者中HER2高表達(dá)，這些患者均對西妥昔單抗原發(fā)耐藥，給這些患者拉帕替尼聯(lián)合曲妥珠單抗的雙重HER2抑制治療，有效率達(dá)34.7%[17]。這也為今后的結(jié)直腸癌的臨床工作提供新的思路，可以把HER2和Ki-67作用評估及治療結(jié)直腸癌的重要靶點(diǎn)。

本課題在進(jìn)行Cox多因素分析分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，HER2和Ki-67并不是結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，原因可能是兩者的陽性判定標(biāo)準(zhǔn)目前尚無統(tǒng)一，這還需進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

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