豨紅通絡口服液改善小鼠炎性和神經病理性疼痛的作用研究*

張 建，黃鳳珍，張 煒，李小軍，李玉桑，唐瀟旖，胡燁胤，商洪才，唐和斌，田貴華

豨紅通絡口服液是由豨薟草、紅花、川牛膝3味藥材組成的復方制劑[1]，在臨床上治療瘀血阻絡所致的中風之癥等。復方制劑中的豨薟草具有祛風濕、通經絡、清熱解毒的功效；紅花可活血通經、化瘀止痛、活血解毒[2]；川牛膝具有活血化瘀、利尿通淋之作用[3]，對巴豆油致小鼠耳廓腫脹有良好的緩解效果[4]。亦有報道指出[5]，豨紅通絡口服液能夠迅速通過血腦屏障進入腦組織，可對腦部疼痛發(fā)揮治療作用。腦卒中后中樞性疼痛屬于神經病理性疼痛，是中風病最為棘手的癥狀之一[6]。因此，本研究擬探討豨紅通絡口服液對完全弗氏佐劑等起炎物質誘發(fā)的炎性腫脹、炎性疼痛和腦出血誘發(fā)的神經病理性疼痛的調控規(guī)律，初步評價其作用機制，為進一步在臨床上推廣使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物 選用SPF級昆明雄性小鼠（6～9周齡，體質量 18～22 g；合格證編號：42000600021454），購買自湖北省實驗動物研究中心。

1.2 藥物與試劑 本實驗所用的中成藥為豨紅通絡口服液（吉林省通化衛(wèi)京藥業(yè)股份有限公司提供，批號20170201）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號1001541106）；醋酸（美國Sigma公司，批號20170122）；二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司，批號10023418）；IV型膠原酶（美國Sigma公司）；蘇木精（南京建成，批號20161209）；伊紅（美國Sigma公司，批號114813194）；甲醛溶液（國藥試劑，批號20160229）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號10009218）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號10010018）；30%過氧化氫溶液；胰蛋白酶（美國 GIBCO，10270-106）；0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，p H 7．2）；兔源 IBA-1 多克隆抗體（美國Millipore，ABN67）；兔源GFAP多克隆抗體（美國Caymen，BA0056）；山羊抗兔Ig G（武漢博士德公司，BA1054）。

1.3 儀器 腦立體定位儀（美國Stoelting，型號ST-51903）；熱痛儀（美國 Ugo Basile，型號 37370）；脫水機（德國萊卡，型號TP1020）；包埋機（德國萊卡，型號 EG1150）；冰凍切片機（德國萊卡，型號CM3050S）；手持式測痛儀（北京碩林苑科技有限公司，型號SLY-HFM）；多光譜成像系統(tǒng)（美國Nuance，型號N-MSI-FX）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立與給藥劑量 1）小鼠耳廓腫脹模型的建立，于小鼠右耳耳廓涂抹50μL二甲苯（Xylene）[7]。2）小鼠炎性疼痛模型的建立，在小鼠左足足底注射50μL完全弗氏佐劑（CFA）[8]。3）小鼠醋酸扭體模型的建立，用注射器腹腔注射0．6%的醋酸（0．01 mL/g）[9]。4）小鼠腦卒中疼痛模型的建立，在腦定位儀于左腦（bregma-0．2 mm，midline 2．0 m m，surface 3．0 mm）注入膠原酶（0．25 μL，0．025 U），造成腦卒中后中樞性疼痛模型[6]。按照4種不同的造模方式，隨機將各個模型的小鼠分成正常組、模型組、低劑量治療組（2μL/g）和高劑量治療組（10μL/g），每組5只。

1.4.2 觀測指標

1.4.2.1 腫脹與疼痛閾值測定 分別于0或1/48、1、3、5 d檢測小鼠的疼痛閾值[10]、足趾腫脹和耳廓腫脹程度。

1.4.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色與Nissl染色、免疫組織化學染色 于第5天實驗結束后，炎性疼痛模型各組小鼠處死后取左足足底皮膚，進行石蠟包埋，行HE染色：觀察組織的炎癥變化情況，每組小鼠選取2張切片，二甲苯脫蠟3次10 min，常規(guī)乙醇梯度脫水，蘇木素核染5 min，溫水返藍5 min，伊紅質染 30 s，封片[11]。

腦卒中模型各組小鼠進行心臟灌注，斷頭取腦組織置福爾馬林溶液中固定，進行石蠟包埋，行Nissl染色：首先腦組織冰凍切片，蒸餾水2 min，Nissl染色液染色3～10 min，蒸餾水洗滌2次；然后95%的乙醇依次5 s，2 min，2 min脫水；接著二甲苯透明2次，每次5 min，最后用中性樹脂膠封片。

免疫組織化學染色：每組小鼠任意選2張切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水。滴加0．3%雙氧水室溫30 min，0．1%胰酶室溫1 h，血清封閉40 min后滴加兔抗鼠一抗溶液-4℃保存過夜，加羊抗兔二抗室溫孵育30 min后，DAB發(fā)色，置于光學顯微鏡下觀察神經細胞和膠質細胞的變化情況，并運用多光譜技術對免疫組化的結果進行定量分析[12]。

1.5 統(tǒng)計方法 豨紅通絡口服液灌胃（每日1次），然后在相應的時間點（1/48 d、1 d、3 d、5 d）進行炎性腫脹程度、疼痛行為變化以及受損腦組織病理損傷進行分組統(tǒng)計，進行數(shù)據收集。同時，實驗整體數(shù)據采用均數(shù)±標準差（x±s）的方法對小鼠耳廓炎性腫脹，足趾炎性腫脹，扭體抑制率，足底機械痛閾，足底熱痛閾數(shù)據處理；采用重復測量方差分析，多光譜定量的比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 豨紅通絡口服液對二甲苯誘發(fā)小鼠耳廓炎性腫脹的影響 通過二甲苯涂抹小鼠耳廓，誘發(fā)了明顯腫脹。耳廓腫脹在第1天達到峰值（模型組腫脹至空白組的（202．02±5．53）%。而相比模型組小鼠，給予豨紅通絡口服液低劑量（2μL/g）、高劑量（10μL/g）治療組的耳廓腫脹程度，得到了明顯緩解，并隨著給藥次數(shù)的增加，效果越來越顯著，在第5天時高劑量治療組治療效果最佳（模型組腫脹至空白組的（202．02±7．14）%，而低劑量和高劑量的治療組分別降至空白組的（162．33±3．27）%與（151．52±8．40）%。見表 1。

表1 各組小鼠耳廓腫脹程度（x±s）Tab.1 Miceauricleswelling（x±s）mm

2.2 豨紅通絡口服液對完全弗氏佐劑誘發(fā)小鼠足趾炎性腫脹的影響 為了確證豨紅通絡口服液對炎性腫脹的改善效果，選用完全弗氏佐劑誘發(fā)小鼠足底炎性腫脹模型。見表2。完全弗氏佐劑誘發(fā)了小鼠的足趾炎性腫脹，并在第1天就達到峰值[模型組腫脹至空白組的（151．77±1．73）%]。相比模型組小鼠，豨紅通絡口服液低劑量和高劑量灌胃處理的小鼠均有明顯恢復，且高劑量治療組治療效果較好（模型組腫脹至空白組的（149．89±1．73）%，而低劑量治療、高劑量治療組分別降至空白組的（135．00±1．25）%與（130．15±1．22）%。為觀察小鼠足趾炎性腫脹的真實性，筆者在行為學檢測結束后取下了小鼠雙足，并進行固定、包埋、HE染色。結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠足底部皮膚組織（完全弗氏佐劑注射側）相較于空白組存在明顯的炎性浸潤，豨紅通絡口服液低劑量和高劑量治療組均有較好的改善。見圖1。

表2 各組小鼠腳趾腫脹程度（x±s）Tab.2 Micetoe swelling（x±s）cm

圖1 小鼠局部皮膚的HE染色Fig.1 HEstaining of local skin

2.3 豨紅通絡口服液對小鼠扭體抑制率的影響 為了觀察豨紅通絡口服液對小鼠炎性鎮(zhèn)痛的效果，選用腹腔注射醋酸。模型組相較于空白組出現(xiàn)了由醋酸誘導的小鼠扭體次數(shù)明顯，而豨紅通絡口服液的低劑量、高劑量治療組隨著給藥時間的增加，能夠明顯抑制小鼠的扭體次數(shù)，且高劑量治療組治療效果更加顯著。見表3。

表3 各組小鼠扭體抑制率比較（x±s）Tab.3 Mice torsion inhibition rate（x±s）%

2.4 豨紅通絡口服液對腦卒中小鼠足底機械痛閾的影響 為了確證豨紅通絡口服液對神經病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經性疼痛模型，檢測小鼠機械痛閾的情況。實驗小鼠的機械痛閾在第1天到達谷值（模型組的痛閾下降至空白組的（43．55±8．57）%），在注入膠原酶之后除空白組其余各組機械痛閾下調明顯，而通過豨紅通絡口服液的灌胃處理，隨著給藥時間的增加，治療組的機械痛閾值有所回調，且高劑量治療效果更佳（模型組的疼痛閾值下降至空白組的（54．83±5．85）%，而低劑量和高劑量治療組則分別回調至空白組的（62．21±2．56）%與（65．26±3．74）%。見表 4。

表4 各組小鼠足底機械痛閾（x±s）Tab.4 Mechanical pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.5 豨紅通絡口服液對腦卒中小鼠足底熱痛閾的影響 為了觀察豨紅通絡口服液對小鼠神經病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經性疼痛模型，檢測小鼠足底熱痛閾的情況。實驗小鼠的足底熱痛閾在第1天到達谷值 [模型組的熱痛閾下降至空白組的（31．91±3．67）%]，在注入膠原酶之后除空白組其余各組足底熱痛閾下調明顯，而通過豨紅通絡口服液的灌胃處理，隨著給藥時間的增加，治療組的足底熱痛閾值回調明顯，且高劑量治療組治療效果更佳[模型組的熱痛閾下將至空白組的（51．83±5．86）%，而低劑量和高劑量治療組分別回調至空白組的（70．02±7．35）%與（81．03±8．11%）]。見表 5。

表5 小鼠足底熱痛閾表（x±s）Tab.5 The thermal pain threshold of mice plantar（x±s）%

2.6 豨紅通絡口服液對腦卒中小鼠腦神經細胞損傷的影響 為了觀察豨紅通絡口服液對小鼠神經病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經性疼痛模型，通過檢測小鼠神經細胞損傷的影響。如圖2所示，從Nissl染色結果來看，空白組中的尼氏小體的著色深并且形狀比較規(guī)整、數(shù)量較多，而模型組的尼氏小體著色較淺，形狀變得不規(guī)整，并且數(shù)量較少，這說明小鼠注入膠原酶后，腦組織受到了損傷，且神經細胞也受到了一些損傷。低、高劑量豨紅通絡口服液治療后，觀察到腦組織中尼氏小體的著色增加，炎癥得到很好的緩解。

圖2 小鼠神經細胞Nissl染色圖Fig.2 Nissl staining of mice nerve cells

2.7 豨紅通絡口服液對腦卒中小鼠腦小膠質細胞異常肥大的影響 為了觀察豨紅通絡口服液對小鼠神經病理性疼痛的改善效果，選用膠原酶誘發(fā)小鼠神經性疼痛模型，檢測小鼠腦膠質細胞的變化情況（多光譜定量）。如圖3所示，實驗模型組相比于空白組的膠質細胞的數(shù)量異常增多，并且形態(tài)變大、變厚，而本研究豨紅通絡口服液低劑量和高劑量治療組相較于模型組都呈現(xiàn)出較小膠質細胞形態(tài)，并且數(shù)量也很少。光譜定量的結果空白組（100.00±2.25）%，模型組（144.53±22.05）%，低劑量治療組（54.84±3.56）%，高劑量治療組（127.27±10.54）%，與空白組的進行比較，模型組的膠質纖維酸性蛋白的表達顯著性上調。進行豨紅通絡口服液治療后膠質纖維酸性蛋白的表達顯著性下調，且高劑量治療組治療效果更為明顯。

圖3 小鼠腦小膠質細胞免疫組化染色圖Fig.3 Immunohistochemical staining of microglia cellsin mice

3 討論

眾所周知，疼痛特別是慢性疼痛（炎性、神經病理性疼痛）給患者帶來的傷害是不言而喻的[13]。本實驗通過化學刺激造模包括腹腔注射醋酸、足底注射CFA及耳廓涂抹二甲苯，誘導產生炎性疼痛，評價豨紅通絡口服液的外周鎮(zhèn)痛效果；以及運用腦卒中造模探究豨紅通絡口服液的中樞性疼痛治療作用。

研究結果發(fā)現(xiàn)富含川牛膝的復方制劑豨紅通絡口服液明顯改善了二甲苯所致的耳廓炎性腫脹和CFA所致的腳趾腫脹。此結果與史玉芬等[4]在小鼠背部皮下注射牛膝具有改善巴豆油所致耳廓腫脹的抗炎效果一致，表明豨紅通絡口服液確有良好的抗炎作用。當然嚴重的炎性腫脹通常會伴隨有異常的疼痛反應。而豨紅通絡口服液既明顯緩解CFA所致的腳趾熱痛閾下降，亦減輕了腹腔注射醋酸所致的扭體疼痛反應，進一步證實了豨紅通絡口服液具有抗炎鎮(zhèn)痛之療效。

基于豨紅通絡口服液對體表炎性腫脹及末梢炎性疼痛反應緩解的良好作用，進一步以腦卒中模型探究豨紅通絡口服液對中樞性神經病理性疼痛的治療效果。通過對受試動物腦組織的神經細胞損傷及膠質細胞異常肥大的評估，結果發(fā)現(xiàn)豨紅通絡口服液不僅能減少腦卒中導致的腦組織中神經細胞損傷及膠質細胞異常肥大，亦緩解了腦損傷引起的痛覺敏化。此結果與秦秀德等[14]尾緣靜脈注射紅花注射液改善急性腦梗死實驗大鼠神經功能的缺損，減輕炎癥的報道相吻合，因為豨紅通絡口服液中也含有紅花這一組分。由此可見適量的豨紅通絡口服液灌胃給藥能發(fā)揮較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，雖然其詳細的鎮(zhèn)痛機制和有效成分仍有待進一步的研究，但其確能改善末梢性的炎性疼痛反應，也能有效緩解中樞部位神經病理性疼痛，有助于指導臨床針對慢性疼痛患者治療的藥物合理選用。

綜上豨紅通絡口服液既能快速減輕起炎物質誘發(fā)的炎癥腫脹和疼痛反應，也能改善腦卒中引起腦組織神經細胞受損及膠質細胞的異常肥大，有效緩解中樞性神經病理性疼痛，發(fā)揮良好的抗炎鎮(zhèn)痛之功效。

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