中國(guó)米蝦bursicon基因的功能及作用機(jī)制

任麗琦 翁潔羊 王 鑫 孫金生 李 冉

(天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300387)

節(jié)肢動(dòng)物的體表有堅(jiān)硬的外骨骼， 包括基膜、表皮細(xì)胞層和角質(zhì)層三部分。外骨骼有保護(hù)內(nèi)部器官， 維持身體形態(tài)， 防止體內(nèi)水分蒸發(fā)， 抵抗化學(xué)或機(jī)械損傷， 阻擋病原微生物入侵等作用[1]。這類堅(jiān)硬的外殼在蝦、蟹、昆蟲(chóng)等中比較常見(jiàn)。由于外骨骼對(duì)節(jié)肢動(dòng)物生長(zhǎng)的限制作用， 所以舊表皮必須間歇式的蛻去并不斷產(chǎn)生新表皮。動(dòng)物剛形成的表皮較為柔軟， 適應(yīng)生長(zhǎng)， 但是容易感染病原微生物或者受到外界損傷， 因此新形成的表皮需要迅速地進(jìn)行鞣化。

1962年Fraenkel、Hsiao和Cottrell將剛羽化的紅頭麗蠅(Calliphora erythrocephala)頸部進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)果其胸部和腹部的表皮沒(méi)有發(fā)生骨化現(xiàn)象， 之后又向這些紅頭麗蠅體內(nèi)注射了正常發(fā)育的同種個(gè)體的血淋巴， 發(fā)現(xiàn)胸部、腹部的表皮開(kāi)始快速發(fā)生骨化[2，3]。所以Fraenkel和Hsiao認(rèn)為在血淋巴中很可能有一種物質(zhì)， 調(diào)控紅頭麗蠅剛剛羽化后新產(chǎn)生的表皮發(fā)生鞣化， 并將其命名為鞣化激素(Bursicon)[4]。此后的40多年里， 盡管有許多關(guān)于鞣化激素生理活性的文章陸續(xù)發(fā)表， 但是一直不能成功分離和純化該激素， 其分子生理學(xué)性質(zhì)也不能確定， 鞣化激素的研究一直沒(méi)有突破性的進(jìn)展。伴隨高通量測(cè)序技術(shù)日漸成熟和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)基因組全序列的公布[5]， Dewey等研究表明在黑腹果蠅中CG13419基因編碼鞣化激素BURS亞基，并且證實(shí)鞣化激素除了可以使分泌形成的新表皮迅速鞣化外， 還與翅的伸展有關(guān)[6]。Bhat等研究證明鞣化激素在許多昆蟲(chóng)中的分子量都大約為30 kD[7]，Honegger等也發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅中的CG13419基因編碼鞣化激素但是其編碼的分泌蛋白僅有15 kD[8]。之后Luo和Mendive等發(fā)現(xiàn)在黑腹果蠅中鞣化激素是一種由2個(gè)胱氨酸結(jié)蛋白構(gòu)成的異源二聚體， 2個(gè)亞基分別是BURS (α)和PBURS (β)。其中PBURS(β)亞基由CG15284基因編碼， 所編碼的分泌蛋白也是15 kD。將CG13419和GG15284在細(xì)胞中一起轉(zhuǎn)染， 兩者共同表達(dá)的蛋白才可以促使頸部結(jié)扎的紅頭麗蠅的表皮發(fā)生骨化[9，10]。

Baker和Truman認(rèn)為[11]， DLGR2是黑腹果蠅鞣化激素的受體， 該受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體并由rickets基因編碼。鞣化激素具體作用機(jī)制被認(rèn)為是Bursicon先和LGR2受體結(jié)合， 導(dǎo)致第二信使的環(huán)腺苷酸(cAMP)大量生成[10]， 進(jìn)一步使下游蛋白激酶A(PKA)被激活， 促進(jìn)酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase)的磷酸化[12]， 酪氨酸(Tyrosine)在活化的酪氨酸羥化酶的催化下轉(zhuǎn)變成多巴(DOPA)， 最后使表皮發(fā)生鞣化； 而且鞣化激素可以經(jīng)cAMP/PKA通路調(diào)控翅的成熟、伸展[13]； BURS或PBURS兩個(gè)亞基還可以分別形成同源二聚體， 通過(guò)IMD通路， 使轉(zhuǎn)錄因子Relish激活， 進(jìn)而參與昆蟲(chóng)的免疫過(guò)程[14]。

在節(jié)肢動(dòng)物的昆蟲(chóng)綱[15—18]、甲殼綱[19—23]、蛛形綱[15]甚至是棘皮動(dòng)物的紫海膽[16]中都發(fā)現(xiàn)了鞣化激素， 特別是在昆蟲(chóng)綱中研究的比較多。在甲殼綱中如普通濱蟹(Carcinus maenas)[19，20]、藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)[21]、歐洲龍蝦(Homarus gammarus)[22]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[23]中也發(fā)現(xiàn)了鞣化激素的存在， 對(duì)該激素合成和釋放部位以及在發(fā)育過(guò)程和蛻皮周期中的表達(dá)模式進(jìn)行了鑒定， 尤其是在藍(lán)蟹中的研究表明鞣化激素的重組蛋白可以促進(jìn)其新表皮角質(zhì)層的增厚。目前鞣化激素在米蝦中尚未有報(bào)道。米蝦屬于甲殼綱(Crustacea)、匙指蝦科(Atyidae)， 包括如多齒新米蝦(Neocaridina denticulate)、彎額米蝦(Caridina curvifrons)、浙江米蝦(Caridina zhejiangensis)等。因?yàn)槊孜r具有個(gè)體偏小， 生長(zhǎng)迅速， 易存活， 繁殖周期短等特點(diǎn)，適合作為生理、生態(tài)等實(shí)驗(yàn)研究的材料。

本研究以米蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 首次克隆了米蝦鞣化激素α和β兩個(gè)亞基基因的開(kāi)放閱讀框片段， 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了米蝦蛻皮周期中兩個(gè)亞基基因的表達(dá)特征。利用RNA干擾技術(shù)分析鞣化激素功能， 為進(jìn)一步研究鞣化激素在米蝦生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理功能提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的中國(guó)米蝦購(gòu)買(mǎi)于浙江， 體長(zhǎng)約1.5—2.5 cm， 健康有活力， 米蝦購(gòu)買(mǎi)回后養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中， 水箱大小為15 cm×20 cm×15 cm， 曝氣， 溫度為26—28℃， 每天投喂蝦糧， 1周更換3次水。

1.2 米蝦總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

按TRIzol?Reagent (Thermo Fisher Scientific)試劑使用說(shuō)明提取米蝦總RNA， 超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和完整性。以總RNA為模板， 參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript?one-step gDNA Remover and cDNA Synthesis SuperMix， 北京全式金生物)說(shuō)明書(shū)， 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈， 使用內(nèi)參基因βactin引物(β-actin F、β-actin R， 表 1)通過(guò)PCR對(duì)cDNA模板進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 米蝦鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β序列的克隆

用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)bursicon-α和bursiconβ的ORF區(qū)的引物(bursicon-α F、bursicon-α R、bursicon-β F、bursicon-β R， 表 1)， 參考ExTaq酶(TakaRa)的使用說(shuō)明書(shū)， 以米蝦cDNA為模板PCR擴(kuò)增目的基因bursicon-α和bursicon-β的ORF區(qū)。bursicon-α反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min； 94℃變性30s， 55℃退火30s， 72℃延伸1min， 35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。bursicon-β反應(yīng)程序的退火溫度為60℃， 其余與bursicon-α反應(yīng)程序相同。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后， 擴(kuò)大體系， 參照使用說(shuō)明書(shū)， 用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)將目的片段切膠回收純化， 連接到pMDTM18-T Vector (Takara)上， 并將菌液送至金唯智生物科技有限公司完成測(cè)序。

1.4 bursicon生物信息學(xué)分析

用DNAStar (version7.1)軟件分析bursicon-α和bursicon-β基因序列和氨基酸序列。利用蛋白組學(xué)在線ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白理化性質(zhì)， 用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域， 用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)檢測(cè)蛋白是否有信號(hào)肽。將bursicon-α和bursicon-β的ORF區(qū)在NCBI (National Center for Biotechnology Information)的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx比對(duì)， 鑒定所編碼的蛋白質(zhì)并且找出多個(gè)同源序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)， 同源序列在BioEdit軟件中進(jìn)行比對(duì)后用MEGA 5.2軟件中的NJ法(Neighborjoining)進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建。

表 1 本研究所用的引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.5 鞣化激素基因bursicon在不同蛻皮周期的表達(dá)特征分析

根據(jù)康現(xiàn)江等[24]對(duì)中華鋸齒米蝦蛻皮周期的分類方法， 可將米蝦的蛻皮周期分為4個(gè)時(shí)期: 蛻皮后期(A-B期)、蛻皮間期(C期)、蛻皮前期(D期)和蛻皮期(E期)。其中D期可進(jìn)一步分為D0-1、D2、D3、D44個(gè)亞期。參考TRIzol使用說(shuō)明書(shū)提取米蝦不同蛻皮時(shí)期胸腹神經(jīng)節(jié)中的RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀FAST7500(ABI)， 以AB期、C期、D0-1期、D2期、D3期、D4期、E期共7個(gè)時(shí)期的cDNA為模板分別檢測(cè)bursicon-α和bursicon-β在不同蛻皮時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)獲得的bursicon-α和bursicon-β的ORF區(qū)的基因序列用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(bursicon-α QPCR F、bursicon-α QPCR R、bursicon-β QPCR F、bursiconβ QPCR R， 表 1)。以β-actin為內(nèi)參基因。參考Fast-Star Universal SYBR Green Master (Rox)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。每組樣品設(shè)3個(gè)平行， 按2–△△Ct法對(duì)得到的數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算后， 用SPSS17.0軟件分析各時(shí)期bursicon-α和bursicon-β相對(duì)表達(dá)量的顯著性差異， 并用Origin 8.0作圖。

1.6 RNA干擾

設(shè)計(jì)bursicon-α和bursicon-β雙鏈RNA片段的特異性引物(dsbursα F、dsbursα R、dsbursβ F、dsbursβ R， 表 1)， 利用HT115菌株來(lái)制備目的基因的雙鏈RNA片段bursicon-αdsRNA (dsburs α)和bursicon-βdsRNA (dsburs β)， 以GFPdsRNA(dsGFP)為對(duì)照。將米蝦分為3組， 用顯微注射器分別向每組米蝦中注射合成的dsRNA (dsGFP組、dsburs α組、dsburs β組)， 每只蝦注射1 μg。第2、第6天分別取樣， 提取總RNA， 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)干涉效果進(jìn)行檢測(cè)。選取處于蛻皮周期D0-1期同等大小的米蝦， 分為4個(gè)組， 分別注射dsGFP、dsburs α、dsburs β、dsburs α與dsburs β質(zhì)量濃度比為1∶1的混合液。注射總量為1 μg/只，48h后每組蝦剪其尾扇并在顯微鏡下觀察所處的蛻皮時(shí)期， 記錄每組蝦從蛻皮后期D0-1期到蛻皮期E期的時(shí)間。

1.7 組織學(xué)觀察

同樣以蛻皮周期處于D0-1期的米蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 分為4組分別注射dsRNA (同上)。當(dāng)米蝦蛻皮周期處于D3期時(shí)， 在舊的外骨骼下生成了新的外骨骼。每組處理組用解剖剪和鑷子將其頭胸部背部舊的外骨骼小心剝離后分別取其新的外骨骼并固定在4%的多聚甲醛中， 石蠟包埋后切片并用甲苯胺藍(lán)染色， 最后用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 bursicon-α和bursicon-β基因的克隆與序列分析

米蝦bursicon-α基因開(kāi)放閱讀框(ORF)為441 bp，編碼146個(gè)氨基酸， 翻譯的蛋白理論等電點(diǎn)為5.67，預(yù)測(cè)分子量為15993.65 Da， 氨基酸序列的1—26位是信號(hào)肽(GenBank登錄號(hào): MG766223)。經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)bursicon-α基因翻譯形成的氨基酸序列具有一個(gè)C末端胱氨酸結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)域(CTCK)， 長(zhǎng)度為89個(gè)氨基酸， 位于氨基酸序列的第31至第119位并且該結(jié)構(gòu)域與二聚體的形成有關(guān)。此外α亞基含有11個(gè)半胱氨酸殘基。bursicon-β基因開(kāi)放閱讀框(ORF)為411 bp， 編碼136個(gè)氨基酸， 翻譯的蛋白理論等電點(diǎn)為6.07， 預(yù)測(cè)分子量為15145.19 Da， 氨基酸序列的1—21位是信號(hào)肽(GenBank登錄號(hào)為MG766224)。bursicon-β基因翻譯形成的氨基酸序列同樣含有一個(gè)C末端胱氨酸結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)域(CTCK)， 長(zhǎng)度為103個(gè)氨基酸， 位于氨基酸序列的第30至第132位。此外β亞基中也含有11個(gè)半胱氨酸殘基。

2.2 米蝦中鞣化激素Bursicon同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用BioEdit軟件， 將米蝦和其他甲殼綱、昆蟲(chóng)綱中13種物種中鞣化激素α亞基的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)后采用MEGA5.2軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 1)。結(jié)果表明米蝦α亞基與甲殼綱十足目的α亞基序列親緣關(guān)系較近， 包括斑節(jié)對(duì)蝦、藍(lán)蟹、普通濱蟹、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)。同時(shí)BLAST分析表明米蝦α亞基與斑節(jié)對(duì)蝦的同源性高達(dá)89%， 親緣關(guān)系最近。

同上述方法相同， 采用MEGA5.2軟件中的NJ法構(gòu)建β亞基系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 2)。結(jié)果表明米蝦β亞基和甲殼綱十足目的斑節(jié)對(duì)蝦、歐洲龍蝦親緣關(guān)系較近。同時(shí)BLAST分析表明米蝦β亞基與斑節(jié)對(duì)蝦的同源性高達(dá)77%， 親緣關(guān)系最近。

2.3 鞣化激素在米蝦蛻皮周期中的表達(dá)特征分析

圖 1 米蝦和其他物種Bursicon-α亞基系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenic tree of bursicon-α subunit in Caridina and other species

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了蛻皮周期中bursicon-α和bursicon-β的相對(duì)表達(dá)量(圖 3)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)米蝦胸腹神經(jīng)節(jié)中bursicon-α和bursicon-β在蛻皮周期不同階段的相對(duì)表達(dá)量存在差異。α和β兩個(gè)亞基的表達(dá)趨勢(shì)相似， 在蛻皮后期(D期)相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始上升， 到蛻皮后期D3期時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，之后相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始下調(diào)， 在蛻皮期E期相對(duì)表達(dá)量最低。

圖 2 米蝦和其他物種Bursicon-β亞基系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenic tree of bursicon-β subunit in Caridina and other species

圖 3 米蝦bursicon-α和bursicon-β在不同蛻皮階段的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of bursicon-α and bursicon-β in Caridina under different molt stages

2.4 RNA干擾沉默鞣化激素基因?qū)γ孜r表型的影響

dsRNA干擾后bursicon基因的表達(dá)特征分析

為了研究鞣化激素基因?qū)γ孜r蛻皮發(fā)揮的作用， 我們采用肌肉注射， 分別將dsburs α和dsburs β注射到實(shí)驗(yàn)組的米蝦體內(nèi)， 之后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)干擾效果(圖 4)。實(shí)驗(yàn)表明， 在干擾48h后， 實(shí)驗(yàn)組中(注射dsburs α、dsburs β)bursiconα和bursicon-β的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組(注射dsGFP)相比顯著下降， 表明dsRNA的干擾效果明顯。

dsRNA干擾后對(duì)蛻皮過(guò)程的影響本研究選取處于蛻皮前期D0-1的米蝦作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象， 注射dsRNA 48h后， 剪取米蝦的尾扇并在顯微鏡下觀察。結(jié)果表明在注射dsRNA2d后， 對(duì)照組即注射dsGFP的米蝦的蛻皮時(shí)期向前推進(jìn)到了蛻皮前期D3期(premolt， D3stage)； 然而分別向米蝦中注射了dsburs α、dsburs β、dsburs α和dsburs β質(zhì)量濃度比為1∶1混合液的三組實(shí)驗(yàn)組蛻皮時(shí)期僅向前推進(jìn)到了蛻皮前期D2期(premolt， D2stage)(圖 5)。與對(duì)照組相比， 實(shí)驗(yàn)組的蛻皮過(guò)程出現(xiàn)了延遲。

對(duì)4組米蝦蛻皮時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 分別記錄從蛻皮前期(D0-1stage)到蛻皮期(E stage)的時(shí)間(圖 6)。結(jié)果表明注射dsGFP的對(duì)照組蛻皮時(shí)間平均為59.9h， 注射dsburs α的實(shí)驗(yàn)組蛻皮時(shí)間平均為89.6h，注射dsburs β的實(shí)驗(yàn)組蛻皮時(shí)間平均為89.9h， 按質(zhì)量濃度比為1∶1注射dsburs α和dsburs β混合液的實(shí)驗(yàn)組蛻皮時(shí)間平均為91.7h。比較4組米蝦蛻皮時(shí)間發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組相比， 3組實(shí)驗(yàn)組從蛻皮前期(D0-1stage)到蛻皮期(E stage)的時(shí)間明顯增加。

dsRNA干擾后對(duì)米蝦甲殼角質(zhì)層厚度和硬度的影響選取處于蛻皮前期D0-1期的米蝦注射dsRNA， 當(dāng)其處于蛻皮前期D3期時(shí)， 將新形成的外骨骼剝離并制作石蠟切片(圖 7A)并對(duì)雙鏈干擾前后米蝦的角質(zhì)層厚度做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖 7B)。結(jié)果顯示， 對(duì)照組中(注射dsGFP)米蝦角質(zhì)層厚度為(3.57±0.18) μm， 注射dsburs α的實(shí)驗(yàn)組中米蝦角質(zhì)層厚度為(1.13±0.12) μm， 注射dsburs β的實(shí)驗(yàn)組中米蝦角質(zhì)層厚度為(1.04±0.15) μm， 注射dsburs α和dsburs β質(zhì)量濃度比為1∶1混合液的實(shí)驗(yàn)組中米蝦角質(zhì)層的厚度為(1.02±0.14) μm。與對(duì)照組相比，3組實(shí)驗(yàn)組注射dsRNA后形成新表皮中角質(zhì)層厚度變薄。

3 討論

鞣化激素屬于神經(jīng)激素。它與昆蟲(chóng)及甲殼動(dòng)物等體壁的骨化(黑化和硬化)有關(guān)， 甚至影響昆蟲(chóng)翅的伸展。以模式昆蟲(chóng)果蠅為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)， 鞣化激素由Bursicon-α (BUR)和Bursicon-β (PBURS)兩個(gè)胱氨酸結(jié)蛋白亞基構(gòu)成[9，10]。目前已經(jīng)在許多不同種昆蟲(chóng)及甲殼動(dòng)物中對(duì)鞣化激素基因有了一定的研究。

圖 4 RNA干擾后bursicon-α和bursicon-β相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間的變化Fig. 4 The relative expressions of bursicon-α and bursicon-β change over time after interfering the dsRNA

圖 5 dsRNA干擾對(duì)米蝦蛻皮過(guò)程的影響Fig. 5 Effect of dsRNA interference during molting process of Caridina

圖 6 dsRNA干擾對(duì)米蝦蛻皮時(shí)間的影響Fig. 6 Effect of dsRNA interference on ecdysis time of Caridina

本文首次克隆獲得了米蝦鞣化激素兩個(gè)亞基基因的ORF區(qū)序列。bursicon-α基因ORF區(qū)長(zhǎng)441 bp，編碼146個(gè)氨基酸；bursicon-β基因ORF區(qū)長(zhǎng)411 bp，編碼136個(gè)氨基酸。序列分析表明， 米蝦中克隆得到的鞣化激素與其他甲殼綱和昆蟲(chóng)綱中的物種有較高的序列一致性， 說(shuō)明克隆得到的基因的確是鞣化激素基因(圖 1、圖 2)。Blast比對(duì)米蝦鞣化激素α亞基與其他13種物種的α亞基序列發(fā)現(xiàn)， 米蝦與藍(lán)蟹、普通濱蟹、克氏原螯蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、水蚤(Daphnia arenata)、大型溞(Daphnia magna)六種甲殼綱物種有68%—89%的相似性； 與煙草天蛾(Manduca sexta)、家蠶(Bombyx mori)、西方蜜蜂(Apis mellifera)、德國(guó)小蠊(Blattella germanica)溫帶臭蟲(chóng)(Cimex lectularius)、黑腹果蠅、家蠅(Musca domestica)七種昆蟲(chóng)有58%到70%的相似度。其中米蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的同源性最高(89%)， 和家蠶同源性最低(58%)。同樣Blast比對(duì)米蝦β亞基與其他13種物種的β亞基序列發(fā)現(xiàn)， 米蝦與斑節(jié)對(duì)蝦、歐洲龍蝦、普通濱蟹、藍(lán)蟹、水蚤、大型溞六種甲殼綱物種有58%到77%的相似度。與煙草天蛾、家蠶、西方蜜蜂、中歐山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、黑腹果蠅、家蠅七種昆蟲(chóng)有47%到54%的相似度。其中米蝦和斑節(jié)對(duì)蝦的同源性最高(77%)， 和家蠶、家蠅同源性最低(47%)。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)米蝦鞣化激素兩個(gè)亞基的氨基酸序列都比較保守。

圖 7 由dsRNA介導(dǎo)的bursicon-α和bursicon-β敲降對(duì)米蝦角質(zhì)層形成和鞣化的影響Fig. 7 The bursicon-α and bursicon-β knockdown mediated by dsRNA impairs the complete formation and tanning of cuticle of Caridina

米蝦Bursicon-α和Bursicon-β都有一個(gè)CT結(jié)構(gòu)域， 并且氨基酸序列中均含有11個(gè)半胱氨基酸殘基。在C1-7、C2-8、C3-9、C4-10、C5-C11間存在二硫鍵， 而且C6是兩個(gè)亞基即BURS和PBURS的聚合位點(diǎn)[9]。在C3和C4之間的氨基酸序列為X-G-X(X代表任意氨基酸殘基)， C6與C7緊密相鄰， C9和C10間隔一個(gè)氨基酸殘基[25]。研究發(fā)現(xiàn)鞣化激素屬于分泌蛋白， 合成以后會(huì)分泌到血淋巴中發(fā)揮作用[26，27]。米蝦的bursicon-α和bursicon-β基因分別含有26和21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽， 屬于分泌蛋白， 與上述結(jié)果相吻合。目前已經(jīng)在藍(lán)蟹[21]和斑節(jié)對(duì)蝦[23]中表達(dá)出了鞣化激素兩個(gè)亞基基因的蛋白， 但是關(guān)于米蝦鞣化激素蛋白的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

蛻皮周期中實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示， 米蝦蛻皮周期各時(shí)期里鞣化激素均有表達(dá)， 在蛻皮前期相對(duì)表達(dá)量逐漸升高， D3期時(shí)達(dá)到最大(圖 3)。這個(gè)結(jié)果與以普通濱蟹為研究對(duì)象的結(jié)果相似[19，20]。這說(shuō)明鞣化激素參與調(diào)節(jié)米蝦蛻皮過(guò)程中表皮的鞣化過(guò)程。已知甲殼動(dòng)物體的外骨骼包括上表皮層(epicuticle)、外表皮層(exocuticle)、內(nèi)表皮層(endocuticle)以及膜質(zhì)層(membranous layer)四層[1]。當(dāng)蛻皮周期處于D0-2階段時(shí)， 上皮細(xì)胞層會(huì)分泌幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等多種酶類并向外運(yùn)輸， 導(dǎo)致膜質(zhì)層和內(nèi)表皮中的成分被降解， 分解后的產(chǎn)物可以重吸收入上皮細(xì)胞層中， 作為新表皮合成的原料[28]。此時(shí)在舊的表皮之下， 新表皮已經(jīng)開(kāi)始逐漸形成。上表皮最先形成， 之后在上表皮之下開(kāi)始出現(xiàn)外表皮[29]。D3-4階段， 肌肉與舊表皮的連接處逐漸被分解， 新表皮增厚但并沒(méi)有發(fā)生鈣化。AB階段， 內(nèi)表皮開(kāi)始形成同時(shí)表皮發(fā)生鈣化[30]。C階段， 外表皮鈣化完全， 新表皮的結(jié)構(gòu)完整， 內(nèi)表皮繼續(xù)鈣化， 整個(gè)表皮變硬[28]。鞣化激素主要是在胸腹神經(jīng)節(jié)中合成， 猜測(cè)在米蝦蛻皮后鞣化激素可能由胸腹神經(jīng)節(jié)釋放到血淋巴中， 促進(jìn)米蝦蛻皮后表皮的鞣化。

鞣化激素是2個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵聚合形成二聚體， 所以2個(gè)亞基應(yīng)該等量表達(dá)， 但在本實(shí)驗(yàn)中蛻皮周期里2個(gè)亞基基因的相對(duì)表達(dá)量并不相等， 猜測(cè)2個(gè)亞基可能既可以形成異源二聚體也可以單獨(dú)形成同源二聚體。An等將重組BURS和PBURS同源二聚體注射到頸部結(jié)扎的黑腹果蠅中， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些免疫相關(guān)的基因表達(dá)量增加， 重組蛋白的注射劑量和時(shí)間的差異使得免疫反應(yīng)發(fā)生的程度不同。并且研究表明注射2個(gè)亞基重組二聚體蛋白的蟲(chóng)體勻漿液對(duì)革蘭氏陰性菌Escherichia coli的生長(zhǎng)有抑制作用。進(jìn)而猜測(cè)， BURS亞基和PBURS亞基分別形成的同源二聚體可能經(jīng)IMD通路與某種新受體結(jié)合參與免疫過(guò)程[14]。在米蝦中關(guān)于鞣化激素與免疫的關(guān)系仍需要進(jìn)一步探討。

本研究利用RNAi技術(shù)， 使得米蝦鞣化激素兩個(gè)亞基的基因沉默， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)敲降結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)組在注射雙鏈RNA 2d后bursicon-α和bursicon-β基因的相對(duì)表達(dá)量就顯著下調(diào)， 說(shuō)明dsRNA作用效果明顯(圖 4)。bursicon-β雙鏈干擾實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組第2天和第4天的表達(dá)量有一些差異(圖4B)， 也許是因?yàn)檫@兩組對(duì)照組中米蝦所處的蛻皮周期不同造成的。另外我們觀察到bursicon-α和bursicon-β基因相對(duì)表達(dá)量下降后米蝦蛻皮周期出現(xiàn)了延遲(圖 5、圖 6)， 該結(jié)果與在赤擬谷盜中的研究結(jié)果相似[31]。同時(shí)米蝦新形成表皮的角質(zhì)層明顯變薄(圖 7)， 這一結(jié)果說(shuō)明， 鞣化激素對(duì)米蝦表皮角質(zhì)層的增厚和鞣化起著非常重要的作用， 和前人在藍(lán)蟹[21]、西方蜜蜂[32]中的研究結(jié)果相似。鞣化激素是一種異源二聚體， Baker和Truman[11]發(fā)現(xiàn)組成鞣化激素的2個(gè)亞基單獨(dú)存在時(shí)并不可以產(chǎn)生作用， 即兩者共同表達(dá)時(shí)， 才能激活受體， 發(fā)揮功能。Luo等[9]對(duì)生物活性的研究發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)bursicon-α和bursicon-β基因都表達(dá)時(shí)頸部結(jié)扎的紅頭麗蠅的表皮才能夠再次鞣化， 結(jié)果表明2個(gè)亞基組成異源二聚體后才有生物活性。所以在本實(shí)驗(yàn)中利用雙鏈RNA干擾技術(shù)將bursicon-α和bursicon-β分別單獨(dú)敲降或共同敲降， 均可使米蝦的蛻皮周期延長(zhǎng)， 甚至角質(zhì)層變薄。已有研究表明， 在昆蟲(chóng)中鞣化激素主要是影響了酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟偷倪^(guò)程[33]。但是在米蝦中鞣化激素對(duì)表皮鞣化的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚， 需要繼續(xù)探索。

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