探討在排除稀釋干擾后溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg的影響

蔣瑤，王東生

(川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 南充 637000)

乙型肝炎病毒(HBV)不僅能引起急慢性感染，亦是肝硬化和肝癌的重要致病因子。HBsAg是病毒HBV在肝細(xì)胞內(nèi)首先表達(dá)的產(chǎn)物，也是人體感染病毒HBV后首先出現(xiàn)的血清標(biāo)志物，因此對(duì)HBsAg高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)對(duì)乙肝的診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義[1]。臨床上，ELISA在檢測(cè)HBsAg時(shí)因其敏感度高、特異性強(qiáng)及適合定性試驗(yàn)的大樣本篩查等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但是實(shí)際上在用此方法檢測(cè)HBsAg時(shí)常常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性及重復(fù)性不好的現(xiàn)象[2]。標(biāo)本溶血、脂血以及黃疸等外源性因素均會(huì)對(duì)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，其中最常見(jiàn)的是標(biāo)本溶血，抽血不當(dāng)或者某些生理病理性因素導(dǎo)致溶血標(biāo)本的形成屬于分析前質(zhì)量控制的環(huán)節(jié)，是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室難以控制的[3]，故明確溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg的影響是非常迫切的。有很多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了大量研究，但在以溶血液為自變量時(shí)未考慮到人為地稀釋了HBsAg濃度和非徹底溶血時(shí)血細(xì)胞對(duì)ELISA測(cè)定HBsAg的影響[1]，未遵循單變量原則?；诖?，現(xiàn)對(duì)陰性標(biāo)本(0 IU/mL)和弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本(0.2～1.0 IU/mL)及強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本(>250 IU/mL)做如下探究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室血液標(biāo)本(無(wú)黃疸、脂血、溶血)65例:由CMIA測(cè)得HBsAg為(0 IU/mL)的陰性標(biāo)本和(0.2～1.0 IU/mL)的弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本及(>250 IU/mL)的強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本各20例,另收HBsAg陰性血液標(biāo)本5例。

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)模塊式血液體液分析系統(tǒng)(希森美康株式會(huì)社)，安圖酶標(biāo)儀(鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，EGATE 2310全自動(dòng)微孔洗板滌機(jī)，北京萬(wàn)泰提供的HBsAg診斷試劑盒，Haier超低溫保存箱，XH-B型漩渦混合器，雅培i2000 SR。

1.3 方法

(1)將5例陰性血液標(biāo)本放入-80 ℃冰箱中2 h后放在37 ℃恒溫箱中孵育30 min，并于低速離心機(jī)離心后用震蕩儀搖勻，反復(fù)以上凍融離心震蕩操作直至完全溶血即在全自動(dòng)模塊式血液體液分析系統(tǒng)上測(cè)得紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)都為0/L。(2)取每例強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性標(biāo)本各100 L 分別加入干燥試管中，再分別加100 L溶血液混勻，此為溶血組。(3)另取每例標(biāo)本100 L，分別加入100 L生理鹽水制成稀釋對(duì)照組。(4)將原未溶血標(biāo)本組、溶血組及稀釋對(duì)照組進(jìn)行配對(duì)依次分組檢測(cè)，每步操作均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)的要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，運(yùn)用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本溶血前后的結(jié)果分析

在HBsAg陰性、弱陽(yáng)性“灰區(qū)”、強(qiáng)陽(yáng)性各20例標(biāo)本中，溶血組與稀釋組的OD值結(jié)果相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即溶血對(duì)HBsAg三組標(biāo)本都有影響，如表1。在20例陰性標(biāo)本中溶血后出現(xiàn)假陽(yáng)性率為40%(8∶20)；20例弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本溶血后檢出假陰性率為45%(9∶20)，且在該次研究中當(dāng)弱陽(yáng)性標(biāo)本HBsAg的濃度≤0.38 IU/mL時(shí)均出現(xiàn)假陰性。

2.2 溶血前后的ELISA檢測(cè)HBsAg的診斷指標(biāo)分析

在所有陰性、弱陽(yáng)性“灰區(qū)”和強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本中，溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg的Sen、Spe、PPV、NPV及診斷效率等指標(biāo)均為負(fù)干擾，如表2。具體地：溶血使ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本的Spe及診斷效率下降，如表3；ELISA對(duì)弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本的診斷效率下降，且溶血使ELISA檢測(cè)弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本的Sen下降，如表4；溶血對(duì)ELISA檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本的診斷指標(biāo)無(wú)明顯影響，如表5。

表1 溶血組與稀釋組的配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

表2 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所有標(biāo)本溶血組前后診斷效能結(jié)果對(duì)比

表3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性組溶血前后診斷效能結(jié)果對(duì)比

表4 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)弱陽(yáng)性“灰區(qū)”組溶血前后診斷效能結(jié)果對(duì)比

指標(biāo)SenSpePPVNPV診斷效率溶血前100%0100%0100%溶血后55%0100%055%

表5 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)強(qiáng)陽(yáng)性“灰區(qū)”組溶血前后診斷效能結(jié)果對(duì)比

指標(biāo)SenSpePPVNPV診斷效率溶血前100%0100%0100%溶血后100%0100%0100%

3 討論

在臨床檢驗(yàn)測(cè)定中常遇到溶血的標(biāo)本，而溶血會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的影響。為明確溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg的影響，在本次試驗(yàn)中以與溶血液同等量的生理鹽水模擬其所造成的對(duì)HBsAg的稀釋干擾，且對(duì)血液完全溶血以排除血細(xì)胞的干擾，則溶血前后結(jié)果不同全由細(xì)胞釋放的內(nèi)容物造成。在ELISA定性實(shí)驗(yàn)中，“陰性”和“陽(yáng)性”間有一個(gè)明確分界點(diǎn)，即“陽(yáng)性判斷值(cut-off值)”。而在本次實(shí)驗(yàn)所用的北京萬(wàn)泰試劑盒的結(jié)果判斷中的臨界值(CUTOFF，簡(jiǎn)稱CO)計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔A均值NC×2.1(陰性對(duì)照孔低于0.05者按0.05計(jì)算)。而cut-off值是在一定的可信度上建立的，只能盡量減少假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生，不能完全避免。

分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：20例陰性標(biāo)本中加溶血液后出現(xiàn)40%假陽(yáng)性率的現(xiàn)象，分析原因可能是溶血后紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白(Hb)，Hb有與辣根過(guò)氧化物酶類(lèi)似的活性[4]，Hb的非特異性吸附及與包被物非特異性結(jié)合可以使產(chǎn)物顏色加深影響結(jié)果判斷[5]，另外細(xì)胞內(nèi)的血紅素對(duì)酶顯色比濁有正干擾。而弱陽(yáng)性“灰區(qū)”標(biāo)本溶血后ELISA檢測(cè)HBsAg的診斷效率為55%，檢出假陰性率為45%，且在該次研究中當(dāng)弱陽(yáng)性標(biāo)本的HBsAg濃度≤0.38 IU/mL時(shí)均出現(xiàn)假陰性，可能是因?yàn)樵诠滔嗝庖邷y(cè)定ELISA中，特異性吸附在固相表面的抗原或抗體的空間構(gòu)象可能由于折疊或功能性結(jié)合部位朝向固相等因素而發(fā)生改變，導(dǎo)致抗原或抗體的活性受影響，抗原和抗體的利用效率因此變低，而且由于弱陽(yáng)性標(biāo)本本身HBsAg含量低并且不穩(wěn)定的性質(zhì)就可造成弱陽(yáng)性標(biāo)本組因溶血干擾后測(cè)定為陰性。

據(jù)上得出，溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg有一定影響，其程度大小還與試劑盒、檢測(cè)人員和采集的標(biāo)本、加樣過(guò)程、藥物等有關(guān)[6]。因此分析前質(zhì)量保證是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系中最重要、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，是確保檢驗(yàn)信息正確、有效的先決條件[7]。在日常體檢、血液中心和血站對(duì)供血者健康檢查中HBsAg的結(jié)果是否準(zhǔn)確有至關(guān)重要的意義:若真陰性HBsAg標(biāo)本被測(cè)為假陽(yáng)性而丟棄，造成血液資源的浪費(fèi)；再者，若真陽(yáng)性HBsAg未準(zhǔn)確檢出，HBV可通過(guò)血液和體液傳播感染醫(yī)護(hù)人員(HCW),盡管乙肝是可用疫苗預(yù)防性疾病，但在HCW日常操作中也應(yīng)引起重視和廣泛防范[8]，故對(duì)溶血標(biāo)本應(yīng)做特殊處理避免假陰性標(biāo)本對(duì)人群的傷害。由于弱反應(yīng)性標(biāo)本自身特異性及免疫檢測(cè)方法的某些缺陷，造成免疫檢測(cè)HBsAg的復(fù)雜性，故應(yīng)選擇敏感性高的檢測(cè)方法以提高檢出率，如用ELISA的雙抗體夾心法定量測(cè)定HBsAg：可用系列濃度抗體或抗原的標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(即劑量反應(yīng)曲線，以抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo))，根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的OD值可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得其濃度或單位，還有方法如TRFIA[9]、分子生物學(xué)方法檢測(cè)HBV DNA核酸如實(shí)時(shí)熒光定量分析法等。

總之，在臨床工作中應(yīng)該避免溶血標(biāo)本進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，且應(yīng)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》規(guī)范日常操作，但若有不可避免因素須接收溶血標(biāo)本時(shí)則應(yīng)明確溶血對(duì)ELISA檢測(cè)HBsAg的影響，可通過(guò)做校正實(shí)驗(yàn)，具體為：在溶血樣本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)其設(shè)置兩個(gè)孔，一個(gè)孔為溶血樣本孔，在這個(gè)孔中加入終止液、顯色劑、底物液以及溶血血清和酶結(jié)合物；另一個(gè)孔為實(shí)驗(yàn)孔，在這個(gè)孔中加入終止液、顯色劑、底物液以及溶血血清，不加入酶結(jié)合物[10]，結(jié)果顯示校正后的的診斷指標(biāo)均得到提高，故可對(duì)溶血標(biāo)本設(shè)置校正孔以提高臨床檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確率。總的來(lái)說(shuō)，ELISA法對(duì)HBsAg的檢測(cè)在非溶血的狀態(tài)下各項(xiàng)診斷指標(biāo)都很好，可在臨床上大批量使用，但若為溶血標(biāo)本應(yīng)具體情況具體分析，探索出適合自己實(shí)驗(yàn)室對(duì)溶血標(biāo)本的校正方法，才能讓所出的檢驗(yàn)報(bào)告具備正確性和說(shuō)服力。

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