組蛋白去乙?；敢种苿㏒25的代謝穩(wěn)定性和表型研究

溫琥玲，田瑞敏，文丹，胥正敏

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；2.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所；3.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000)

近年來，組蛋白酶去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor，HDACI)成為腫瘤靶向治療研究領(lǐng)域的新熱點。組蛋白去乙?；竿ㄟ^去除組蛋白的乙?；笵NA緊密的纏繞在組蛋白上，導(dǎo)致DNA不易被相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄因子接觸；進而使受損細胞凋亡，周期阻滯、分化等相關(guān)的蛋白表達受到抑制，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。HDACI通過增加腫瘤細胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?，改變細胞周期、細胞凋亡相關(guān)基因表達水平，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，抑制腫瘤增殖和(或)促進細胞凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成等；發(fā)揮腫瘤治療或預(yù)防的作用[2-5]。依據(jù)HDACI結(jié)構(gòu)不同，分為四類：脂肪酸、氧肟酸鹽、環(huán)肽和苯酰胺類，S25是本實驗室新合成的苯酰胺類HDACI[6]。新合成的化合物的代謝性質(zhì)關(guān)系到整個化合物是否能夠成藥，并真正的運用到臨床的重要影響因素。肝微粒體是藥物代謝的主要場所[7]，在本研究中，我們將通過體外構(gòu)建的包括人在內(nèi)的不同種屬肝線粒體系統(tǒng)研究S25藥物的代謝特征，為該藥的進一步基礎(chǔ)和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

S25：由本實驗室合成；大鼠肝微粒體(RLM)、人肝微粒體(HLM)、犬肝微粒體(DLM)、猴肝微粒體(MLM)、小鼠肝微粒體(MouLM)購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80 °C冷凍保存；NADPH發(fā)生系統(tǒng)：A液、B液，購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80 °C冷凍保存；去離子水：Milli-Q實驗室自制；甲醇：色譜純，批號166578，F(xiàn)isher Scientific公司；乙腈：色譜純，批號155174，F(xiàn)isher Scientific 公司；甲酸：色譜純，純度99%，ACROS ORGANICS。

超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)：SIL-30AC autosampler，LC-30AD chromatograph，CBM-20A communications bus module，CTO-20AC prominence column oven，購自SHIMADZU公司。三重四極桿質(zhì)譜(MS)：AB SCIEX QTRAP5500質(zhì)譜儀。色譜柱：Waters Acquity UPLCTM BEH C18 column(2.1×50 mm，1.7 μm)；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(Thermo Scientific公司)；230V-UK渦旋混合器(Labnet International公司)；電子天平(賽多利斯儀器(北京)有限公司)；移液槍(德國 Eppendorf公司)恒溫水浴鍋：DF-101S，購自北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液配制 精密稱取一定量的S25，用甲醇溶解成1 mg/mL的儲備液，4 ℃保存，待用。精密稱取一定量的內(nèi)標(biāo)苯酰胺類HDACI辛二酰苯胺異羥肟酸(Suberoylanilide Hydroxamic Acid，SAHA)，用甲醇溶解成1 mg/mL的儲備液，4 ℃保存，待用。

1.2.2 UPLC-MS/MS條件 (1)色譜條件：色譜柱Waters Acquity UPLCTM BEH C18 column(2.1×100 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；樣品室溫度15 ℃；柱溫30 ℃；進樣體積1 μL；流動相A 0.1%甲酸水，B 甲醇，梯度洗脫見表1。(2)質(zhì)譜條件：電噴霧離子化(ESI)方式，檢測離子為正離子，MRM模式；毛細管電壓5 kV，離子源溫度500 ℃，簾氣 20 L/h, 去簇電壓(DP)120 V。S25和內(nèi)標(biāo)化合物的MRM檢測條件，見表2。

表1 S25流動相梯度洗脫條件

表2 F18和SAHA質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

1.2.3 S25在不同種屬肝微粒體中代謝穩(wěn)定性 孵育體系總體積為100 μL，體系包括0.1M pH 7.4 的PBS 94 μL，A液 5 μL，B液 1 μL；在冰浴上加入1 μL S25溶液(濃度100 μM)，37 ℃水浴預(yù)孵育5 min，分別加入2.5 μL各種屬肝微粒體溶液，繼續(xù)溫孵0，5，15，30，45，60，60 min后加500 μL的含內(nèi)標(biāo)50 ng/mL的冰乙腈終止反應(yīng)，渦旋混勻3 min，13 000 rpm離心15 min，取上清液，進樣。上述每組樣品均平行操作3份。

1.2.4 S25體外代謝動力學(xué)參數(shù)分析 以各孵育時間點的濃度與孵育0 min時間點S25的濃度相比得剩余百分量，將各時間點的剩余百分量的自然對數(shù)對孵育時間作線性回歸，求算得斜率k，根據(jù)以下公式可以計算得到半衰期和清除率。其中人、大鼠、比格犬、猴、和小鼠的相關(guān)的理化參數(shù)如下: Liver (g) / BW (kg) 分別為22、40、33、33 和87.5；Microsomes (mg) / Liver (g)為45[8]。

t1/2=-0.693/k

1.2.5 S25在大鼠肝微粒體中代謝表型 按上述穩(wěn)定性實驗孵育體系，冰浴上加1 μL濃度為100 μM的S25，1 μL各選擇性化學(xué)抑制劑，在37 ℃水浴中預(yù)熱5 min，然后冰浴上加入2.5 μL的肝微粒體酶，輕輕混勻。37 ℃水浴中孵育60 min，反應(yīng)完畢之后加入500 μL含SAHA濃度為50 ng/mL的乙腈溶液(4 ℃)終止反應(yīng)。

另設(shè)定未發(fā)生反應(yīng)樣品為陰性對照組(不加NADPH發(fā)生系統(tǒng)，不加抑制劑，只加入等量甲醇)；設(shè)定完全發(fā)生反應(yīng)為陽性對照組(加入NADPH發(fā)生系統(tǒng)，但不加抑制劑，只加入等量甲醇)。采用UPLC-MS/MS方法檢測S25原形剩余含量，考察不同選擇性抑制劑對S25代謝的影響。用待測物的消除速率表示待測物在微粒體孵育體系中的代謝速率；用Excel、Graphpad prism 5.0和SPSS statistics17.0軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)處理和制圖。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

按照“1.2.5”項條件，分別制備實驗肝微粒體溫孵液樣品加內(nèi)標(biāo)，滅活肝微粒體空白液樣品，再進行LC-MS分析該方法的專屬性[9-10]。S25和內(nèi)標(biāo)SAHA達到基線分離，分離度良好，二者的保留時間分別是2.61 min和3.10 min，提示該方法專屬性良好(圖1)。

2.2 準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)測定

于滅活肝微粒體中加入S25，分為低、中、高3個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液：31.25、125、400 ng/mL，每個質(zhì)量濃度5個平行樣品；分析計算各質(zhì)量濃度樣品回收率，表示準(zhǔn)確度。同樣方法制備系列質(zhì)控樣品，日內(nèi)分別進3次，連續(xù)3 d各進樣1次，計算日內(nèi)、日漸精密度，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)表示。由表3可見，該藥回收率99.41%～106.42%，日內(nèi)和日間精密度均小于15%，表明該方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。同樣用測定準(zhǔn)確度和精密度的方法制得S25質(zhì)控樣品，同時配制相同質(zhì)量濃度的S25對照品溶液，LC-MS分析檢測到峰面積分別為A和B，抑制抑制率為=(1-A/B)×100%，基質(zhì)效應(yīng)表示為=A/B×100%。其機制抑制率1.09%～6.81%(表3)，小于15%，提示該提取方法無基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 S25在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性

由S25在人、大鼠、小鼠、犬和猴肝微粒體中孵育時間和底物剩余百分比作散點圖可見，S25在這5種屬肝微粒體中均有明顯代謝；并將S25剩余百分?jǐn)?shù)的自然對數(shù)和孵育時間用線性回歸分析(圖2)，S25在各種屬肝微粒體中0～60 min均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。其代謝動力學(xué)參數(shù)見表4，S25在人、小鼠兩種屬肝微粒體中代謝較快且較相近，半衰期T1/2不足1 h，分別在45 min和43.31 min，在大鼠、猴和犬肝微粒體中代謝半衰期時間較長，2～4 h，與人肝微粒體中代謝時間相差較大；在人和小鼠兩個種屬中的代謝清除率也半衰期一樣接近。

表3 S25的準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果(n=5)

表4 S25在人、小鼠、大鼠、犬和猴肝微粒體中代謝穩(wěn)定性測定結(jié)果

指標(biāo)人大鼠小鼠犬猴T1/2min45.00187.3043.31130.75198.00CLint/mL·min-1·kg-10.0310.0070.0320.0110.007

2.4 S25在人肝微粒中代謝表型的確定

人肝微粒體中各選擇性P450化學(xué)抑制劑對S25的代謝酶活性的影響見表5和圖3。二乙基二硫代氨基甲酸鈉(CYP2E1特異性抑制劑) ，鹽酸塞氯匹定(CYP2C19特異性抑制劑) 和抑制劑磺胺苯吡唑(CYP2C9抑制劑)對人肝微粒體中S25的代謝酶活性抑制率分別是99.99%、84.64%和81.43%，與不加化學(xué)抑制劑的陽性對照組相比，代謝酶活性差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其他抑制劑如α-奈黃酮(CYP1A2)和毛果蕓香堿(CYP2A6)對人肝微粒體中S25的代謝酶活性抑制與不加化學(xué)抑制劑的陽性對照相比代謝酶活性無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；表明CYP2E1，CYP2C19和CYP2C9可能是主要參與代謝S25的酶表型。

表5 各抑制劑對人肝微粒中S25代謝的影響

3 討論

組蛋白乙酰化使染色體構(gòu)型發(fā)生改變而變得疏松，有利于DNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。正常狀態(tài)下組蛋白乙?；腿ヒ阴；D(zhuǎn)移酶處于相對平衡狀態(tài)。當(dāng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，去乙?；富钚栽鰪姡{(diào)控細胞周期和增殖凋亡的基因表達失控，從而使細胞發(fā)生異常增殖而惡變。HDACI能使抑癌基因活化，重新調(diào)控細胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而具有潛在的臨床意義[11]。目前，已有部分HDACI運用于臨床治療乳腺癌、肺癌等實體腫瘤，也有用于血液系統(tǒng)腫瘤如急性早幼粒細胞白血病(APL)和急性髓性白血病(AML)等[12]。由此可見組蛋白去乙?；敢种苿┦强鼓[瘤藥物研究的熱點。

S25系本實驗室合成的新型組蛋白去乙?；敢种苿?，目前還沒有其作為新藥運用前的代謝動力學(xué)方面的研究。因此本實驗建立了人肝微粒體中S25的UPLC-MS/MS檢測方法，其線性、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和專屬性均符合生物樣品的測定標(biāo)準(zhǔn)。由本實驗的代謝穩(wěn)定性實驗結(jié)果可見，S25在人和小鼠中的代謝半衰期較短，而與其它3種種屬中代謝半衰期相比差異較大。由此可見，藥物動物實驗和臨床前實驗數(shù)據(jù)推測臨床給藥方案時，要注意種屬或個體的代謝速率差異。

候選化合物在不同種屬的肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性和代謝表型研究對于化合物體內(nèi)的代謝性質(zhì)有很好的預(yù)測作用，是藥物開發(fā)前期評估候選化合物的有效手段[13]。代謝穩(wěn)定性的結(jié)果提示小鼠與人的代謝性質(zhì)比較接近，大鼠、犬和猴的代謝性質(zhì)和人差異比較大，后期實驗動物的選擇可以通過這個結(jié)果來做出比較好的判斷；代謝表型的實驗結(jié)果表明肝微粒體中主要參與S25的代謝酶可能有： CYP2E1，CYP2C9，和 CYP2C19，；而CYP1A2和CYP2A6對S25則沒有明顯的代謝作用。S25有多種酶代謝，這將降低由于體內(nèi)某種酶被特異性抑制或誘導(dǎo)而導(dǎo)致的嚴(yán)重不良反應(yīng)的風(fēng)險。本研究確定了該藥物在人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性以及該藥物的代謝表型，為今后對該藥物進行進一步的代謝機制方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] Bereshchenko OR,Gu W,Dalla-Favera R.Acetylation inactivates the transcripitional repressor BCL6[J],Nature Genetics,2002,32(4):606-613.

[2] Smith BC,Denu JM.Chemical mechanisms of histone lysine and arginine modifications[J].Biochim Biophys Acta,2009,1789(1):45-57.

[3] Yoshida M,Kijima M,Akita M,etal.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A[J].J Biol Chem,1990,265(28):17174-17179.

[4] Sanchez R,Zhou MM.The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription[J].Curr Opin Drug Discov Devel,2009,12(5):659-665.

[5] Gregoretti IV,Lee YM,Goodson HV.Molecular evolution of the histone deacetylase family：functional implications of phylogenetic analysis[J].J Mol Biol,2004,338(1):17-31.

[6] WangH,LimZY,ZhouY,etal.Acylurea connected straight chain hydroxamates as novel histone deacetylase inhibitors：Synthesis，SAR，and in vivo antitumor activity[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2010,20(11):3314-3321．

[7] Jang Su Jeon,Soo Jin Oh,Ji-Yoon Lee,etal.Metabolic characterization of meso-dihydroguaiaretic acid in liver microsomes and in mice[J].Food and Chemical Toxicology,2015,76:94-102．

[8] Yan Z,Caldwell GW．Metabolism profiling，and cytochrome P450 inhibition & induction in drug discovery[J].Current topics in medicinal chemistry,2001，1(5):403-425．

[9] Chang LC,Gerhauser C,Song L,etal.Activity-guided isolation of constituents of Tephrosia purpurea with the phase enzyme, quinone reductase[J].J Nat Prod,1997,60(9):869.

[10] 張曼，孟志云，朱曉霞，等．毛喉鞘蕊花提取物福司可林的體外代謝研[J]．藥學(xué)學(xué)報，2013，48 (3)：383-389.

[11] Stephen S,Andy IC,Craig O,etal.A phase I/II study of vorinostat(SAHA),cladribine(2-CdA), and rituximab shows significant activity in previously untreated mantle cell lymphoma[J],Blood,2011,118:441.

[12] Prine HM,George DJ,Pamaik A,etal.Phase study of oral LBH589,a novel deacetylase(DAC) inhibitor in advanced solid tumors and Non-Hodgkin’s lymphoma[J].J Clin Oncol,2007,25(Suppl):18s.

[13] Tucker GT,Houston JB,Huang SM.Optimizing drug development:strategies to assess drug metabolism/transporter interaction potential-toward a consensus[J].Pharm Res,2001,18(1):107-117.