長期單純高尿酸血癥大鼠主動脈病理變化

劉淑芬，王 琦，馬 亞，曾學(xué)軍

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 物理醫(yī)學(xué)康復(fù)科, 北京 100730；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京 210029； 3.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 超聲科, 北京 100020;4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 普通內(nèi)科, 北京 100730)

近年來，國內(nèi)外大樣本臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥(hyperuricemia，HU)可以增加人體發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險[1- 2]，這些結(jié)果越來越被臨床關(guān)注， 甚至有專家提出應(yīng)該開始對合并心腦血管危險因素的HU患者進行治療[3]。迄今，基礎(chǔ)研究對于HU升高心血管疾病發(fā)病風(fēng)險的機制研究甚少，HU是否能夠引起或加速動脈粥樣硬化尚無確證研究。本研究建立長期HU大鼠模型,來觀察單純HU12周能否引起大鼠主動脈動脈粥樣硬化病理變化，并對HU的致病機制進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：SPF級SD雄性大鼠16只，體質(zhì)量200～250 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK(京)2016- 0006]。所有動物實驗經(jīng)過單位倫理委員會批準，對動物處置方法符合動物倫理學(xué)要求。

實驗試劑：氧嗪酸鉀(濟南中科一通化工有限公司)；尿酸(Sigma Aldrich公司)；氧嗪酸鉀大鼠飼料(每10 kg飼料內(nèi)加入200 g氧嗪酸鉀,北京科奧協(xié)利飼料有限公司)；普通大鼠飼料(北京科奧協(xié)利飼料有限公司)；尿酸飲水(尿酸用滅菌動物飲用水配成 100 μmol/L溶液)自配；氧嗪酸鉀灌胃液(氧嗪酸鉀用滅菌動物飲用水配成 100 mg/mL混懸液)自配。

1.2 方法

大鼠分組及處理：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采集基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后，將大鼠隨機分成空白對照組及HU組，空白對照組給予普通飼料、水飼養(yǎng)，HU組給予氧嗪酸鉀飼料+尿酸飲水飼養(yǎng)，給藥第7、14、21、28、35、49、63、77和84天下午將大鼠禁食12～14 h，次晨稱質(zhì)量，乙醚麻醉后經(jīng)內(nèi)眥采血,監(jiān)測血尿酸水平，維持造模組血尿酸持續(xù)顯著高于空白對照組。

標本獲?。簩嶒為_始后第84天(12周末)， 經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血后處死大鼠，向上剪開胸腔，在胸腔內(nèi)找到心臟和胸腹主動脈，剔除周圍脂肪組織及疏松結(jié)締組織，將胸腹主動脈剪下，0.9%的氯化鈉溶液清洗一下腔內(nèi)血塊，剪去1段腹主動脈放入已標號的含甲醛溶液的小瓶內(nèi)固定。

HE染色：大鼠主動脈標本的經(jīng)固定、包埋和切片，HE染色，光鏡下測定主動脈內(nèi)膜-中膜厚度變化、內(nèi)膜炎性細胞浸潤及內(nèi)膜表層脂紋脂斑形成情況。

免疫組化：大鼠主動脈標本的經(jīng)固定、包埋和切片，免疫組織化學(xué)法測定eNOS、ET- 1、ICAM的表達，用著色細胞平均吸光度值指標進行分析，所有病理圖像均使用計算機顯微圖像分析系統(tǒng)(image-pro plus6.0)。

ELISA和酶法：大鼠內(nèi)眥取血后，立即離心取血清，保存于-25 ℃冰箱中，使用全自動生化分析儀Olmpus AU 5400，進行血尿酸檢測，使用ELISA進行ET- 1和ICAM的檢查，使用酶法進行血清NO的檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果2.1 動物一般資料

第14天時，HU組血清尿酸(UA)濃度(239±38)μmol/L較對照組(189±29)μmol/L顯著升高(P<0.05)；之后，HU組大鼠血清尿酸濃度均較對照組顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 兩組大鼠各時間點血清尿酸濃度Fig 1 Serum UA at different days

2.2 主動脈病理改變

2.2.1 主動脈形態(tài)學(xué)變化

2.2.1.1 內(nèi)膜-中膜厚度變化：正常對照組動脈壁內(nèi)膜表面完整光滑無損傷，中膜平滑肌排列整齊，厚薄均勻。HU組部分大鼠可見動脈壁內(nèi)皮細胞水腫和脫落(2/8)，中膜平滑肌細胞排列紊亂(2/8)，部分平滑肌有細胞水腫和增殖，內(nèi)膜灶性增厚(2/8)。內(nèi)膜-中膜厚度輕度增加(圖2)。

2.2.1.2 內(nèi)膜炎性細胞浸潤：正常對照組內(nèi)膜表面光滑完整無損傷，內(nèi)皮細胞排列緊密無脫落，少見單核細胞、巨噬細胞等炎性細胞黏附和浸潤(圖2A)。HU組部分大鼠可見內(nèi)皮細胞腫脹，部分脫落；1只大鼠內(nèi)膜出現(xiàn)大量單核細胞、巨噬細胞和泡沫細胞聚集(圖2B)。

A.arota in control group(×200)；B.arota in HU group(×200)； C.arota in control group(×400)；D.arota in HU group(×400)

圖2大鼠主動脈HE染色
Fig2RatarotaHEstaining

2.2.1.3 內(nèi)膜脂斑形成情況：HU組1只動物動脈內(nèi)膜出現(xiàn)小脂斑，表現(xiàn)為泡沫細胞聚集，周邊可找到單核巨噬細胞，但病灶內(nèi)未找到變性的膠原纖維(圖2B)。

2.2.2 主動脈eNOS、ET- 1、ICAM蛋白表達變化

2.2.2.1 主動脈eNOS表達：高倍鏡下陽性細胞的細胞漿染成黃褐色提示有eNOS表達，HU組主動脈內(nèi)膜黃染的eNOS表達較對照組明顯減少(216±33vs308±42，P<0.05)(圖3)。

A.arota in control group(×400)； B.arota in HU group(×400)圖3 大鼠主動脈eNOS染色Fig 3 Rat arota eNOS staining

2.3.2.2 主動脈ET- 1表達：高倍鏡下陽性細胞的細胞膜和細胞漿染成黃褐色提示有ET- 1表達。HU組主動脈內(nèi)膜的ET- 1表達顯著高于對照組(423±45vs278±31，P<0.05)(圖4)。

2.2.2.3 主動脈ICAM表達：高倍鏡下陽性細胞的細胞膜和細胞漿染成黃褐色提示有ICAM表達。與正常對照組比較，HU組主動脈內(nèi)膜的ICAM表達明顯增強(356±28vs210±23，P<0.05)(圖5)。

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)圖4 大鼠主動脈ET- 1染色Fig 4 Rat arota ET- 1 staining

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)圖5 大鼠主動脈ICAM染色 Fig 5 Rat arota ICAM staining

2.3 血清ET- 1、ICAM、NO濃度

實驗結(jié)束時D84，HU組大鼠血清ET- 1和ICAM均較對照組顯著升高;而 NO較對照組顯著降低(表1)。

表1 兩組大鼠血清ET- 1、ICAM、NO濃度

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

3 討論

本研究通過長期氧嗪酸鉀飼料以及尿酸水喂養(yǎng)與氧嗪酸灌胃合并的方法，建立了長期高尿酸血癥(hyperuricemia，HU)大鼠模型，發(fā)現(xiàn)造模12周后HU組大鼠可見動脈壁內(nèi)皮細胞水腫、脫落，內(nèi)膜灶性增厚，中膜平滑肌細胞排列紊亂，內(nèi)膜-中膜厚度輕度增加，浸潤于內(nèi)膜的炎性細胞數(shù)輕度增多；免疫組化顯示HU組主動脈內(nèi)膜eNOS表達較對照組顯著減少， ET- 1和ICAM表達較對照組明顯增多，且HU組血清NO較對照組顯著降低，ET- 1和ICAM較對照組顯著升高。

在高血脂、高血糖與動脈粥樣硬化的關(guān)系的早期研究中，通過高脂、高糖動物模型的建立，觀察高血脂、高血糖對動脈的直接影響，為其致病機制提供了重要信息[4- 7]。但既往直接觀察單純高尿酸血癥對主動脈的結(jié)構(gòu)影響的研究很少，可能原因推測如下：短期高尿酸血癥對主動脈不可能產(chǎn)生明顯的變化，而長期高尿酸血癥動脈模型造模非常困難[8]。本研究建立的HU模型發(fā)現(xiàn)，其主動脈的變化與早早期(糖尿病模型8周)時有些類似變化。

2015年，一項選用新西蘭白兔進行的動物實驗，也發(fā)現(xiàn)了跟本研究類似的現(xiàn)象，看到了HU組內(nèi)膜的增厚，也未看到典型的動脈粥樣硬化斑塊[9]。其與本研究的不同之處在于內(nèi)膜厚度變化更顯著。分析該研究與本研究產(chǎn)生差異的原因如下:1)選用的實驗動物不同，該研究選用的動物為新西蘭白兔，本研究選用的動物為S-D大鼠，大鼠的體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程與人類存在較大差距，可能不利于觀察到典型動脈粥樣硬化表現(xiàn)[10- 11]。2)樣本量有所差異：該研究的每組動物為12只，而本研究僅為8只。

綜上所述，長期單純高尿酸血癥(12周)本身，尚不足以引起大鼠主動脈典型的動脈粥樣硬化，但其能夠引起主動脈的eNOS表達下降，ET- 1、ICAM表達增加。

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