糖尿病大鼠心肌組織中自噬相關(guān)基因Atg7和Atg12-Atg5表達(dá)降低

王 藝，王 瑞，張 帥，鄧 蕊，胡 峰，陳睿琦，張秀冰，劉曉健

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1.第一臨床學(xué)院 2013級英文班； 2.第一臨床學(xué)院2012級17班；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室；遼寧 錦州 121001)

自噬是一個降解壞死細(xì)胞器及變性蛋白質(zhì)的過程，在促進(jìn)細(xì)胞存活、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和保持細(xì)胞健康過程中起著重要作用。研究表明在多種疾病的發(fā)生發(fā)展與治療過程中均可有自噬現(xiàn)象的變化[1- 2]。近年來，自噬對糖尿病心肌病的影響也受到重視，但目前研究的自噬在糖尿病心肌損傷中的變化和作用仍結(jié)論不一[3- 6]。

Atg (autophagy-related)基因是最先在酵母鑒定出的一組自噬相關(guān)基因。自噬過程中涉及一系列的相關(guān)基因的表達(dá)。其中，Atg12-Atg5綴合物是由一個泛素樣的共軛系統(tǒng)形成的，對于自噬的中心事件——自噬體的形成，是至關(guān)重要的[7]，而Atg7是活化Atg8(即自噬標(biāo)志性蛋白LC3)和Atg12的關(guān)鍵上游分子[8]。

本研究應(yīng)用鏈脲佐菌素糖尿病大鼠心肌組織探討糖尿病心肌損傷過程中自噬的變化，為進(jìn)一步研究糖尿病心肌病的發(fā)病機制和干預(yù)治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)、蛋白酶抑制劑cocktai(Sigma-Aldrich公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液(碧云天試劑公司)；GAPDH抗體(Santa Cruz公司)和Atg5和Atg12-Atg5抗體(Cell Signal公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗(Earthox公司)；蛋白Marker(Thermo Fisher公司)。

1.1.2 動物：SPF級SD大鼠，雄性，空腹體質(zhì)量為(235±10)g[遼寧長生生物技術(shù)有限公司，SYXK(遼)2014- 0010]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將大鼠分為對照組(NC)49只和糖尿病模型(DM)組85只。以尾靜脈注射鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)50 mg/kg制備大鼠糖尿病模型，造模成功72只。分別在成模后的第10、20、30、40、60、80和100 d，結(jié)束動物飼養(yǎng)。去除成模后死亡8只，血糖回落16只，最終每組動物在每個時間點的數(shù)量為6～8只。所有大鼠自由進(jìn)食和飲水，每周定時監(jiān)測大鼠的體質(zhì)量和尾靜脈血葡萄糖等情況。

1.2.2 心肌標(biāo)本收集：經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠后，迅速取出心臟，計算左心室質(zhì)量指數(shù)(左心室質(zhì)量/體重，mg/g)。取部分左心室心肌組織快速放入-80 ℃冰箱凍存，待測蛋白表達(dá)。另取一部分大鼠心尖部待進(jìn)行透射電鏡檢測。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)：冰上剪碎心肌組織后，加入含有1%蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，冰中超聲碎裂組織后，再在冰上裂解40 min，4 ℃以12 000 r/min離心15 min。取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入5×樣品緩沖液混合后, 煮沸5 min。各個樣品取等量總蛋白，經(jīng)SDS- 聚丙烯凝膠中電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用1% BSA封閉2 h后, 按預(yù)染Marker標(biāo)記的分子質(zhì)量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入GAPDH、Atg7和Atg12-Atg5抗體，4 ℃搖床孵育過夜。二抗(1∶8 000稀釋)室溫作用1 h后，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.2.4 心肌組織電鏡檢測：3%戊二醛、1%鋨酸先后固定，包埋，制備超薄切片，鈾鉛雙染，透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 左心質(zhì)量指數(shù)

隨著鼠齡增長，對照組大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)稍有降低，而DM組大鼠的左心質(zhì)量指數(shù)則明顯升高(40 d，P<0.05；80 d，P<0.01)(表1)。

表1 糖尿病對大鼠體質(zhì)量和左心質(zhì)量指數(shù)的影響

*P<0.05,**P<0.01 compared with NC group.

2.2 心肌組織中自噬相關(guān)蛋白Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表達(dá)

隨著鼠齡的增加，對照組大鼠的心肌組織中Atg7和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)呈增多趨勢(40 d時，Atg7，P<0.05，Atg12-Atg5，P<0.05；圖1A，B)。而在DM組，隨著病程的發(fā)展，大鼠心肌的Atg7和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)先稍增加而后則顯著減弱(60 d，P<0.05)(圖1C，D)。

與同一時間的對照組比較，至80 d時的DM心肌組織中Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01，圖2A，B)。

2.3 DM組大鼠心肌組織中自噬小體減少

對照組大鼠的心肌肌原纖維排列整齊，線粒體呈圓或橢圓形，膜結(jié)構(gòu)清晰，嵴排列規(guī)則密集，自噬小體/自噬小泡多見(圖3A，B)。DM組大鼠的心肌肌原纖維相對稀疏、排列稍有紊亂、 偶有斷裂， 線粒體增多、變圓、膜與嵴結(jié)構(gòu)不清晰，偶見脂滴存在，自噬小體/自噬小泡明顯減少(圖3C)。

A.representative bands in group of NC; B.quantity results normalized to GAPDH of fig A;**P<0.01,*P<0.05 compared with NC10; C.representative bands in group of NC; D.quantity results normalized to GAPDH of Fig C;**P<0.01,*P<0.05 compared with DM10

A.representative bands; B.quantity results normalized to GAPDH of Fig A; *P<0.01 compared with NC80圖2 相同時間點的正常大鼠和糖尿病大鼠的心肌組織Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表達(dá)

A.ultrastructure of myocardial tissue in the normal rats(×8 000); B.magnified area of the squared area in A(×25 000); C.ultrastructure of myocardial tissue in the diabetic rats(×8 000); the white arrows showed the autophagosomes or autophagic vacuoles

圖3正常大鼠和糖尿病大鼠(80d)的心肌組織的超微結(jié)構(gòu)
Fig3Ultrastructureofmyocardialtissueinthenormalratsanddiabeticratsat80days

3 討論

糖尿病的患病率正以驚人的速度增長，預(yù)計到2025年，全球約5%的人口會患有糖尿?。欢R床研究表明，心力衰竭的發(fā)病率在糖尿病人群中比非糖尿病人群高約2～4倍[9]。因此，研究糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新機制,對其防治具有重要的理論意義和實際價值。

目前普遍認(rèn)為糖尿病心肌病的發(fā)生主要與心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運缺陷、冠狀動脈微血管病變、心肌間質(zhì)纖維化和心臟自主神經(jīng)病變以及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[10]。近年來自噬現(xiàn)象在糖尿病心肌病中的作用也備受重視。細(xì)胞可通過自噬為其重建、再生和修復(fù)提供必須原料，實現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用。自噬的發(fā)生過程是嚴(yán)格受自噬相關(guān)基因(Atg)調(diào)控的大量蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物所控制的，每種蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)調(diào)控自噬體啟動與形成的不同階段。其中，Atg7的蛋白表達(dá)與Atg12-Atg5綴合物形成都是重要的調(diào)控環(huán)節(jié)[7]。

本研究以剛成年的SD大鼠建立STZ糖尿病模型，多個時間點觀察了左心質(zhì)量指數(shù)及心肌組織中自噬相關(guān)基因Atg7和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著鼠齡的增長、體質(zhì)量的增加，左心質(zhì)量指數(shù)在正常大鼠呈現(xiàn)減少趨勢，而糖尿病大鼠卻呈現(xiàn)上升趨勢，特別是60 d后差異更為顯著，表明糖尿病隨著病程進(jìn)展引起大鼠心肌出現(xiàn)了明顯的病變。通過檢測Atg7和Atg12-Atg5的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨時間推移，模型組大鼠的心肌表現(xiàn)為先稍增加而后顯著減弱的變化，特別是達(dá)病程80 d后，左心質(zhì)量指數(shù)與蛋白表達(dá)的變化差異均特別顯著，提示自噬現(xiàn)象的動態(tài)變化可能影響了大鼠心肌組織的病變過程。心肌超微結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果也顯示：與同時間的正常大鼠相比，在病程80 d時，糖尿病大鼠心肌的肌原纖維、線粒體均發(fā)生病理改變，同時自噬小體也明顯減少。即本研究中，糖尿病病程發(fā)展到80 d時，大鼠心肌組織中自噬水平顯著降低，與近年來的一些研究結(jié)果基本一致[3,5 ]。然而，本研究中對照組大鼠隨著鼠齡增加，心肌組織中Atg7和Atg12-Atg5蛋白表達(dá)有增多改變，該結(jié)果與參考文獻(xiàn)[5]報道不一致，可能與實驗動物的種類和年齡不同有關(guān)，提示進(jìn)行此類研究，對照組必須是同齡動物。本研究多個時間點的檢測結(jié)果還顯示：在病程早期自噬現(xiàn)象稍有增多改變，雖然未見統(tǒng)計學(xué)意義，但至少說明病情發(fā)展到一定程度后才出現(xiàn)自噬減少的。該結(jié)果提示，可能在糖尿病早期，心肌組織中維持的一定水平的自噬，有利于糖尿病大鼠的心臟形態(tài)與功能維持于相對正常狀態(tài)；而在病程達(dá)80 d時，大鼠心肌的病理改變已十分顯著，自噬水平也呈現(xiàn)顯著降低，其原因很可能是隨著糖尿病病情的發(fā)展，心肌組織再難以維持一定水平的自噬，而正是由于自噬的明顯減少，糖尿病大鼠的心肌組織不能有效地完成氨基酸的再循環(huán)與清除受損的細(xì)胞器，不能使細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)與有效重塑，進(jìn)而出現(xiàn)顯著的心肌組織損傷。

總之，本研究表明了自噬現(xiàn)象在糖尿病心肌損傷過程中發(fā)生了明顯變化，可能起重要作用，通過干預(yù)自噬來預(yù)防和延緩糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展值得進(jìn)一步研究。

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