食管癌患者外周血中miR-181b-5p表達(dá)水平下降

古麗尼格爾·雪合拉提，王延蛟，祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼，娜孜拉木·玉蘇甫江，斯坎德?tīng)枴ぐ卓肆?/p>

(新疆醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

中國(guó)是食管癌發(fā)病率和病死率較高的地區(qū)[1]，全國(guó)發(fā)病率占第6位，病死率占第4位。與此同時(shí)，食管癌也是新疆地區(qū)人群中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，病死率達(dá) 155.9/10 萬(wàn)[2]。然而，當(dāng)患者確診時(shí)，病程往往已經(jīng)發(fā)展為進(jìn)行性吞咽困難并出現(xiàn)惡病質(zhì)癥狀，5年生存率低于15%[2]。因此，尋找食管癌特異性較強(qiáng)、靈敏度高的血清標(biāo)志物，提高其早期診斷率并改善患者預(yù)后是目前食管癌領(lǐng)域中迫切需要解決的問(wèn)題。

microRNAs(miRNAs)通過(guò)促進(jìn)或抑制來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)， 其表達(dá)水平發(fā)生紊亂是誘發(fā)一系列腫瘤形成的重要因素，同時(shí)miRNAs也可作為腫瘤標(biāo)志物用于食管癌、肝癌等惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估，并有望在食管癌的早期診斷方面取得進(jìn)展，成為食管癌治療靶點(diǎn)[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)miRNA芯片分析篩選患者外周血單一miRNA候選指標(biāo)，并用RT-qPCR法進(jìn)行檢測(cè)和比較，探討其對(duì)食管癌的診斷和預(yù)后評(píng)估的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料：收集2013年4月至2013年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診或住院治療的36例食管癌患者，其中男24例，女12例，平均年齡64；并選取26名健康志愿者。所有食管癌患者均符合食管癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診?；颊咭话阗Y料之間相比無(wú)差異，具有可比性，設(shè)置健康志愿者為對(duì)照組。食管癌組患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診并符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，入選對(duì)象年齡范圍48～71歲，性別和民族不限；患者無(wú)其他位置腫瘤；實(shí)驗(yàn)前未經(jīng)放化療以及相關(guān)抗腫瘤藥物治療；所有患者無(wú)心血管疾病以及腎功能不全；所有患者平素身體狀況較好，無(wú)感染性疾病及血液系統(tǒng)疾??；食管癌患者和健康志愿者均同意實(shí)驗(yàn)措施，并簽署知情同意書(shū)。不符以上條件患者均排除實(shí)驗(yàn)對(duì)象。此研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑：miRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

內(nèi)參U6引物序列：上游引物：5′-GCTTCGGCA CATATA-3′；下游引物：5′-CGAATTTGCGTGTCATC CTT-3′；miR-181b-5p引物序列：上游引物：5′-AA CACGCAACATTCATTGCTG-3′；下游引物：5′-GTCG TATCCAGTGCAGGGT-3′。

1.2 方法

委托北京博奧生物有限公司對(duì)白細(xì)胞總RNA的miRNA芯片篩查分析，并篩選差異表達(dá)候選單一miRNA，RT-qPCR法進(jìn)行檢測(cè)比較。收集全血樣本3 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min。Trizol法提取外周血白細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

食管癌組患者外周血白細(xì)胞miR-181b-5p表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)(圖 1)。

*P<0.01 compared with control圖1 正常對(duì)照組與癌組的miR-181b-5p表達(dá)水平Fig 1 Expression of miR-181b-5p in control group

miR-181-a和內(nèi)參基因U6的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)，均出現(xiàn)特異的單峰，曲線整齊可信。

3 討論

食管癌是惡性腫瘤之一，具有早期診斷難、預(yù)后差等特點(diǎn)。中國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家，食管癌目前的診斷率仍然很低，且對(duì)食管癌的治療方法仍以手術(shù)為主，患者術(shù)后的 5年總生存率僅為 15%[4]。近年來(lái)，腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、腫瘤的篩查、腫瘤的診斷及鑒別診斷、腫瘤的分期、腫瘤的檢測(cè)和預(yù)后判斷等方面發(fā)揮著重要作用。miRNA的異常表達(dá)可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5]，研究腫瘤患者外周血液中特異性miRNAs，既可以探索其在腫瘤發(fā)病機(jī)理中的作用，也可以用于腫瘤早期診斷的血清標(biāo)志物的篩查，實(shí)現(xiàn)腫瘤的“早發(fā)現(xiàn)，早治療”。miRNAs廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子 RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、代謝以及疾病的發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用[8]。miRNAs表達(dá)異常的現(xiàn)象普遍存在于多種腫瘤中，已經(jīng)有研究報(bào)道，miRNAs通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路直接或間接參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

A.dissociation curre 1; B.amplification curre; C.dissociation curre 2圖2 U6與miR-181b-5p的熔解曲線和擴(kuò)增曲線Fig 2 Dissociation curve，amplification curve of U6 and miR-181b-5p

本研究通過(guò)miRNA芯片分析篩選食管癌患者外周血差異表達(dá)的miR-181b,探討其在食管癌中的診斷和預(yù)后中的意義。miR 181家族有4個(gè)成員：miR-181(a、b、c、d)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)(miRNA.org)分析預(yù)測(cè)，它們有相同的靶基因：INPP4B和PHLPP2。INPP4B基因通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和血管生成等過(guò)程，是一種新發(fā)現(xiàn)的潛在腫瘤抑制因子。INPP4B基因在胃癌患者外周血[6]、前列腺癌[7]、結(jié)腸癌及乳腺癌[8]中的表達(dá)水平均下調(diào)，但在食管癌中的研究不多。PHLPP2是[9]新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其主要功能抑制AKT通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖，它的異常表達(dá)與卵巢癌[10]和肺癌[11]相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，食管癌患者外周血中miR-181b-5p的表達(dá)水平明顯低于健康志愿者，與報(bào)道[12]中通過(guò)表達(dá)上調(diào)抑制細(xì)胞增殖的結(jié)果相一致。推測(cè)miR-181b-5p在食管癌中可能有新的作用靶點(diǎn)，也可能在食管癌中的低表達(dá)是促癌作用的表現(xiàn)。因此，miR-181b-5p可否有望成為食管癌患者新的特異性診斷指標(biāo)或預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，甚至是有效的臨床治療靶點(diǎn)，尚待進(jìn)一步深入研究。

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