TMEM38B純合突變導(dǎo)致罕見ⅪⅤ型成骨不全癥

呂 芳，徐曉杰，高 鵬，宋玉文，夏維波，邢小平，李 梅*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科 衛(wèi)生部內(nèi)分泌重點實驗室；2.骨科， 北京 100730)

成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)是一組臨床表型和基因型具有明顯異質(zhì)性的罕見結(jié)締組織病，其發(fā)病率為1/10 000～20 000，主要臨床表型包括骨骼脆性增高、反復(fù)骨折和骨骼畸形，骨骼外表現(xiàn)包括藍鞏膜、牙本質(zhì)發(fā)育不全和聽力異常等[1]。

目前已發(fā)現(xiàn)至少19種致病基因(http://www.le.ac.uk/ge/collagen/)，其中85%～90%由 Ⅰ型膠原編碼基因COL1A1和COL1A2突變所致，呈常染色體顯性遺傳，其他基因突變通過影響Ⅰ型膠原合成、翻譯后修飾、折疊、膠原交聯(lián)、骨骼礦化或成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致OI[1]。

1 材料與方法

1.1 對象

患者，男，2歲9月，維吾爾族人，因“反復(fù)骨折1年9月”，于2016年就診于北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科。患者為第1胎第1產(chǎn)，母親孕期平順，足月順產(chǎn)，出生體重2.7 kg，身長不詳?；颊?歲學(xué)習(xí)走路時出現(xiàn)右脛骨骨折，此后輕微外力下再骨折3次，分別為左脛骨和雙股骨骨折，均行外固定治療。既往史無殊。家族史：父母為近親婚配(圖1)，體健，否認(rèn)骨折家族史。查體：身高83 cm(小于同性別和同年齡兒童-3SD)，體質(zhì)量12 kg(位于同性別和同年齡兒童-1SD到中位數(shù))，未見牙本質(zhì)發(fā)育不全，鞏膜稍藍，粗側(cè)聽力正常。雙下肢呈膝內(nèi)翻畸形，四肢關(guān)節(jié)韌帶無松弛。無脊柱側(cè)突和后突畸形，胸廓無畸形。

本研究獲北京協(xié)和醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)，在研究開始前征得患者父母同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床表型評估：在北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科采用常規(guī)方法檢測血清鈣、磷、總堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和肌酐；采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測β-膠原降解產(chǎn)物、25羥維生素D和全段甲狀旁腺素。在放射科完成頭顱及胸腰椎側(cè)位、雙股骨和脛腓骨正位X線平片檢查，采用雙能X線吸收儀(DXA，GE Lunar公司)測定患者腰椎1- 4、股骨頸和全髖部位骨密度。

1.2.2 致病基因突變檢測：采集患者及其父母外周靜脈血，提取基因組DNA(采用QIAampDNA Blood Mini試劑盒)。采用二代高通量捕獲測序平臺(next generation sequence, NGS, Illumina HiSeq2000平臺)檢測OI致病基因，該平臺覆蓋19種已知成骨不全癥的致病基因(包括COL1A1、COL1A2、IFITM5、PPIB、SERPINF1、CRTAP、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、PLOD2、P3H1、P4HB、PPIB、SEC24D、SPARC、WNT1和CREB3L1)和700余種其他罕見骨病的候選基因。目標(biāo)區(qū)域堿基覆蓋度為98.95%，測序深度達200×。

圖1 患者家系圖Fig 1 Pedigree of the OI family

針對NGS平臺發(fā)現(xiàn)的致病突變，采用Primer 3軟件設(shè)計引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴增相應(yīng)外顯子及其與內(nèi)含子交界區(qū)。上游引物序列：5′-CACCCACATTTAAAGTCCC T-3′，下游引物序列：5′-GTGATAGAATTATGGCTCC CT-3′。PCR擴增產(chǎn)物純化后，用熒光自動測序儀(ABI3700)直接測序，結(jié)果與參考序列NM_018112.2比對，以確定患者基因突變位點及類型，進一步與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和成骨不全癥數(shù)據(jù)庫(http://www.le. ac.uk/ge/collagen/)比對，確定其是否為新型突變位點。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床表型特點

患者幼年起病，主要表現(xiàn)為反復(fù)輕微外力下骨折，并逐漸出現(xiàn)雙下肢骨骼畸形，鞏膜稍藍，無聽力異常及牙本質(zhì)發(fā)育不全等骨骼外表現(xiàn)?；颊吒文I功能正常，血鈣：2.48 mmol/L(參考范圍：2.13～2.70 mmol/L)，磷：1.87 mmol/L(參考范圍：1.29～1.94 mmol/L)，總堿性磷酸酶：180 U/L(參考范圍：42～390 U/L)，甲狀旁腺素：18.5 pg/mL(參考范圍：12.0～65.0 pg/mL)，均在正常范圍內(nèi)。25羥維生素D：9.5 ng/mL (參考范圍：20～50 ng/mL)，提示維生素D嚴(yán)重缺乏，骨吸收指標(biāo)β-膠原降解產(chǎn)物濃度：1.55 ng/mL(參考范圍：0.26～0.512 ng/mL)，高于正常。骨骼X線片示胸腰椎骨質(zhì)疏松，雙股骨、脛骨彎曲畸形，雙股骨和右側(cè)脛骨骨皮質(zhì)不連續(xù)，局部骨痂形成，顱骨未見明顯縫間骨(圖2)。骨密度：腰椎1-4為0.292 g/cm2(Z評分為-4.97)，股骨頸為0.207 g/cm2(Z評分為-7.55)，全髖為0.275 g/cm2(Z評分為-5.21)。因患者骨折未愈合，僅給予鈣劑和維生素D制劑治療，暫未予雙膦酸鹽治療。

2.2 OI致病基因突變分析

NGS采用SOAP aligner 軟件對原始數(shù)據(jù)進行分析，比對多個正常人群單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，如單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP build 137)，千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫(the 1 000 Genomes Project)和華大公司內(nèi)部數(shù)據(jù)庫，以常染色體顯性遺傳<1%，常染色體隱性遺傳<0.5%為閾值，鑒別單核苷酸多態(tài)性。進一步分析可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常的突變，包括框移突變、無義突變、錯義突變和剪切位點突變等。發(fā)現(xiàn)患者存在TMEM38B純合突變：第4外顯子507位核苷酸G突變?yōu)锳(c.507G>A)。Sanger測序證實上述結(jié)果。該突變導(dǎo)致169位色氨酸提前終止，產(chǎn)生截短蛋白(p.W169X)，其父母親均為攜帶者(圖3)。該突變在國內(nèi)外OI患者中均有致病性報道[2- 4](表1)。

由于DEDS固有的離散性和內(nèi)部機制的復(fù)雜性，往往難以用常規(guī)的差分方程、微分方程等數(shù)學(xué)模型來描述，同時關(guān)于系統(tǒng)動態(tài)過程的解析表達也很難得到，而離散事件系統(tǒng)仿真則能借助仿真的方式很好地描述DEDS各方面的性能，因此，它是目前研究DEDS最為流行的方法之一。

A.lateral films of the skull: no wormian bones at the occipital region; B.lateral films of the spine: osteoporosis without vertebral compression fractures; C.anteroposterior films of the femur and tibiofibular: bilateral bowing femurs and tibiofibular with fractures, slender long bone with thin cortices

圖2成骨不全癥患者的影像學(xué)表現(xiàn)
Fig2RadiologicalfindingsinpatientwithOI

A homozygous mutation ofTMEM38Bwas identified as: c.507G>A in exon 4.this parents were both asymptomatic heterozygous carriers for the mutation

圖3TMEM38B測序結(jié)果
Fig3SangersequencingresultsoftheTMEM38B

3 討論

本研究確診一例以反復(fù)輕微外力下骨折為主要表現(xiàn)的OI兒童患者。患者存在低骨密度、長骨纖細(xì)且骨皮質(zhì)菲薄的骨骼特點。生化檢查提示維生素D缺乏、骨吸收指標(biāo)升高。NGS發(fā)現(xiàn)TMEM38B第4外顯子具有純合突變(c.507G>A，p.W169X)。

TMEM38B于2012年首次被報道導(dǎo)致OI ⅪⅤ型，該基因位于9q31.2，編碼跨膜蛋白38B[5]。跨膜蛋白38B為B型三聚物的細(xì)胞內(nèi)陽離子通道(trimeric intracellular cation channel type B，TRIC-B)，在大多數(shù)組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達，對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放和儲存有重要作用[4，6- 7]。鈣離子參與I型膠原的合成、折疊、修飾和分泌等多個環(huán)節(jié)[4]，Ca2+依賴的激酶/磷酸酶信號通路參與多能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[8- 9]。因此，TMEM38B突變可影響上述多個環(huán)節(jié)，導(dǎo)致骨骼脆性增加，反復(fù)骨折。

目前已報道5種TMEM38B突變導(dǎo)致OI(圖4)，本研究首次在維吾爾族患者中發(fā)現(xiàn)TMEM38Bc.507G>A突變導(dǎo)致ⅪⅤ型OI (表1)。TMEM38B所致OI患者多為中重度臨床表型OI，僅少數(shù)病情較輕，部分可有藍灰色鞏膜、聽力異常和心臟瓣膜異常等骨骼外表現(xiàn)[2- 5, 9- 11]。本例與既往報道的TMEM38B突變患者臨床表型類似。

OI臨床診斷主要依賴于家族史、骨骼脆性增加和典型的骨骼外表現(xiàn)，影像學(xué)檢查可以協(xié)助診斷，尚缺乏OI特異的生化指標(biāo)。本例患者主要表現(xiàn)為反復(fù)骨折，無OI家族史，僅有鞏膜稍藍的骨骼外表現(xiàn)，因此診斷OI前需要進行鑒別診斷。現(xiàn)已有報道顯示超過100種非創(chuàng)傷性疾病可導(dǎo)致骨骼脆性增加，如致密性成骨不全癥、Hajdu-Cheney綜合征、低磷骨軟化、青少年特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、骨硬化癥和先天性無痛癥等[12]。大多數(shù)疾病通過臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查和致病基因突變檢測，能夠很好地進行鑒別診斷。

OI尚無根治性治療方法，雙膦酸鹽為最常用的治療藥物， 可通過抑制破骨細(xì)胞活性， 增加骨密度，減少骨折發(fā)生率。本中心曾報道三例TMEM38B突變患者接受雙膦酸鹽治療，治療后骨密度升高，骨折率下降[2]，但是雙膦酸鹽在OI ⅪⅤ型中的療效尚需在大樣本患者中進一步證實。

1-6.exon 1-6 of TMEM38B圖4 已報道的TMEM38B的突變信息(A)和TRIC的分子模式圖(B)Fig 4 Previous reported mutation information of TMEM38B(A) and topology model of TRIC channels(B)

familypatient(n)originsexsillencetypeage1stfracture(years)numberoffracturesdeformityBShearinglossDIBPstreatmentefficacyofBPsRef12ChineseHanMOIⅣ1.4-1.62-6nonononoyesBMD↑[2]2-46TurkishMOIⅣ0-20-13variablewhitetoblueNANAyesBMD↑,fracture↓[9]5NATurkeyNANANANANANANANANANA[3]61ChineseUygurMOIⅢ14yesyesnonononointhisresearch

BS.blue sclerae; DI.dentinogenesis imperfecta; BPs.bisphosphonates.

本研究確診一例以反復(fù)輕微外力下骨折為主要表現(xiàn)的維吾爾族OI兒童患者，證實TMEM38B第4外顯子純合突變(c.507G>A，p.W169X)為其致病基因。對于幼年起病、反復(fù)骨折的患者，需重視OI的可能，應(yīng)積極進行致病基因突變檢測，有助于明確診斷及指導(dǎo)臨床治療。

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