利用CRISPR /CAS9技術(shù)構(gòu)建QKI敲除GC1-spg細胞株及其生物學功能檢測

鐘順順，李 凱，楊 陽，繆時英，王琳芳，宋 偉

(中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

近年來，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于細胞、動物和植物等方面的研究，對生命科學的研究有重要意義，它相比于傳統(tǒng)的基因編輯——鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，更加精準和高效[1]。

QKI(quaking, QKI)是一類RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，可通過選擇性剪切可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生QKI5、QKI6和QKI7 3種轉(zhuǎn)錄本，都具有同源的KH結(jié)構(gòu)域[2]。目前，QKI的研究主要集中在神經(jīng)、 心血管系統(tǒng)等研究領(lǐng)域[3- 5]。在生殖領(lǐng)域，QKI突變的雄性小鼠不育，其睪丸組織切片中幾乎沒有精子的存在，附睪組織中僅有精子頭部和尾部畸形的無運動能力的精子[6]，表明QKI在精子發(fā)生中也有重要作用。

目前關(guān)于QKI在精子發(fā)生中的功能與機制的研究較少，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了GC1-spg細胞系的QKI基因中與RNA結(jié)合的KH結(jié)構(gòu)(K Homology domain, KH)的敲除細胞株，并從細胞增殖、分化等方面初步探索QKI在精子發(fā)生中的可能功能，為深入揭示QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能和機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠精原細胞系GCI-spg(本課題組保存)；真核表達質(zhì)粒px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(本實驗室保存)；轉(zhuǎn)染所用試劑Lipofectamine(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco-BRL公司)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；gRNA序列(擎科生物科技有限公司合成)；anti-QKI抗體(Millipore公司)；anti-Tubulin抗體和嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司)；辣根過氧化物酶標記的抗小鼠；兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Cell Counting Kit- 8(同仁化學研究所)；Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit(Roche公司)；TransStart Tip Green qPCR Super Mix(Transgen Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 敲除靶點的設(shè)計及QKI的測序引物設(shè)計：利用麻省理工學院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/設(shè)計QKIDNA區(qū)域的一對oligoDNAs，根據(jù)得分高低選擇合適的一對引導(dǎo)RNA序列。同時，在QKI敲除區(qū)域的上下游選擇合適的位置設(shè)計測序引物，用于后續(xù)的PCR鑒定和測序檢測。

1.2.2 質(zhì)粒和重組體的構(gòu)建：將合成的兩條oligo DNAs按照上游下游各100 pmol的比例進行100 ℃反應(yīng)10 min，后自然降溫退火至室溫，形成雙鏈DNA，與PX330質(zhì)粒用T4連接酶連接，進而轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆，進行測序確認后，提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及單克隆的篩選：根據(jù)GC1-spg細胞的特征，選擇Lipofectamine做轉(zhuǎn)染試劑，按照其說明書提供的方法進行轉(zhuǎn)染細胞，待質(zhì)粒表達36 h后，用加入3 mg/L嘌呤霉素，待陰性對照中細胞完全死亡，停止加藥，待細胞長到適當數(shù)量，進行單克隆分選，挑選有效單克隆細胞，擴大培養(yǎng)至可用來DNA測序和Western blot驗證。

1.2.4 Western blot檢測蛋白的表達：將構(gòu)建成功的PX330重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GC1-spg細胞，培養(yǎng)48 h后，收取細胞，用1×SDS裂解液(50 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8, 125 μL 80%甘油, 10% SDS, 625 μL H2O)裂解細胞樣品，致使細胞呈黏稠透明液體，100 ℃變性10 min，后用BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，分離蛋白，用320 mA進行恒流轉(zhuǎn)膜，后用相應(yīng)的各抗體進行檢測。

1.2.5 CCK8測量增殖曲線：在96孔板中種植一定數(shù)量(1 000個)細胞，12 h后待細胞完全貼壁后，加入10% CCK8檢測液和90% DMEM完全培養(yǎng)基的混合液。將細胞置于培養(yǎng)箱孵育75 min后，檢測450和630 nm處吸光度值，檢測細胞增殖情況。

1.2.6 q-PCR對mRNA水平的檢測：利用 Trizol法提取細胞中的總RNA，后用Transcriptor First Strand cDNA Synthetsis Kit進行反轉(zhuǎn)錄，再進行熒光定量PCR檢測c-kit、Stra8、Lhx8、Hspa2、Zfp42和Mtl5的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建GC1-spg的QKI敲除細胞株

2.1.1 靶點設(shè)計示意圖：QKI基因敲除靶點位置(圖1)，敲除靶點序列長度為20 bp，1#靶點和2#靶點分別位于KH的+67到+86處和+13到+32處(1#靶點序列為：5′-GGATGTAAAATAATGGTCCG-3′，2#靶點序列為：5′-GGGAGAATCCTTGGACCTAG-3′)

2.1.2 Western blot與測序驗證敲除細胞株：獲得1#靶點單細胞株3株，2#靶點單細胞株3株，Western blot檢測結(jié)果(圖2A)，其中1#06測序結(jié)果(圖2B)得到GTCCGAG堿基缺失突變體，測序峰圖結(jié)果(圖2C)表明突變細胞株是在該區(qū)域因堿基缺失造成移碼突變。后續(xù)功能檢測實驗均選擇1#06進行實驗。

2.2 QKI對GC1-spg細胞增殖與分化的影響

2.2.1 QKI蛋白對于細胞增殖的影響：測定QKI敲除成功的細胞株增殖曲線結(jié)果(圖3)，實驗組Cas-QKI細胞增殖明顯慢于對照組(P<0.05)。

圖1 QKI基因敲除靶點Fig 1 Diagram of QKI gene target site

A.cells were collected for Western blot; B,C.cells were collected for PCR, and B.sequence PCR product compared with wild type, C.sequencing peak map, the red line marked the mutation

圖2敲除細胞株的鑒定
Fig2Identificationoftheknock-outcellstrain

*P<0.05 compared with control group圖3 CCK8檢測QKI對細胞增殖的影響Fig 3 CCK8 method was used to detect the proliferation of QKI-knocking out cells

2.2.2 QKI蛋白對于細胞分化的影響：檢測減數(shù)分裂相關(guān)分子標志基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)實驗組c-kit、Mtl5的表達量相較于對照組有顯著降低(P<0.01)，Hspa2表達量也低于對照組(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖4 QKI蛋白對細胞進入減數(shù)分裂的影響Fig 4 Effect of QKI protein on cells’ meiosis

3 討論

在體外機制的研究中，常用RNA干擾(RNA interference, RNAi)進行基因沉默，影響蛋白質(zhì)表達，但是由于siRNA的持續(xù)作用時間較短，一般傳代2～3代就會失效，而且受細胞的轉(zhuǎn)染效率和狀態(tài)影響大，靶點的敲低效率也不穩(wěn)定，同時對于一些周期比較長的實驗不適用，所以本研究選擇利用CRISPR/Cas9構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，可以解決RNAi的技術(shù)弊端。

由于QKI有3個轉(zhuǎn)錄本，就其序列進行分析，其3個轉(zhuǎn)錄本高度同源，僅在3′端氨基酸序列與個數(shù)不同，其QUA結(jié)構(gòu)域具有介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的作用；KH可以與RNA結(jié)合，通過與RNA結(jié)合參與生物學過程。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對GC1-spg細胞的QKI進行KH結(jié)構(gòu)域定點敲除，共篩出6株單細胞(1#靶點3株，2# 靶點3株)。CRISPR/Cas9技術(shù)雖然持續(xù)周期較長(2個月左右)，但是其敲除效率高，構(gòu)建出的細胞株可以穩(wěn)定缺失QKI，構(gòu)建成功的細胞株不會因為傳代次數(shù)增多而恢復(fù)，所以可以為體外功能與機制研究提供合適的細胞模型。

目前QKI在精子發(fā)生中的功能與機制的研究較少，本研究利用上述構(gòu)建的QKI敲除細胞模型，初步觀察了該基因?qū)ι毎脑鲋澈头只挠绊憽?/p>

由上述實驗結(jié)果得出QKI可以影響細胞增殖；在檢測c-kit、Stra8和Lhx8這些減數(shù)分裂早期關(guān)鍵分子[7- 8]與 Hspa2、Zfp42和Mtl5 等減數(shù)分裂后期的關(guān)鍵分子[9- 10]時，c- kit、Mtl5和Hspa2的表達量變化都提示了QKI蛋白在精子發(fā)生過程中具有重要作用；這些將為深入揭示QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能奠定了良好基礎(chǔ)。

但是精子發(fā)生是一個特殊的分化過程，涉及生物學過程很多，而目前生精細胞在體外的培養(yǎng)和繼續(xù)減數(shù)分裂難度大，本研究中選擇的GC1-spg也僅是永生化的精原細胞株，不能全面代表精子發(fā)生的整個過程，所以要真正闡釋QKI蛋白在精子發(fā)生中的功能表型與詳細機制，還需進一步結(jié)合體內(nèi)的功能研究。

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