黃芩苷協(xié)同頭孢他啶對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜的影響

閉 關(guān) 羅 勁 杜仲業(yè) 劉唐娟 陳一強(qiáng)

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧，530021）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.a）是臨床常見的重要致病菌，可引起肺炎、腦膜炎和心內(nèi)膜炎，甚至膿毒血癥、金黃色葡萄球菌燙傷樣綜合征等全身感染[1]。金黃色葡萄球菌慢性感染遷延難愈的重要原因之一是細(xì)菌生物膜的形成；生物膜能協(xié)助細(xì)菌逃避免疫識(shí)別和免疫清除，降低抗生素的滲透能力，從而增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性[2]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能與其他抗生素協(xié)同作用，抑制細(xì)菌生物膜形成，增強(qiáng)抗生素殺菌效力[3-4]，本研究以克拉霉素作陽(yáng)性對(duì)照，探討黃芩苷與頭孢他啶聯(lián)合作用后，對(duì)早期形成的金黃色葡萄球菌生物膜形成是否起抑制作用，以求從傳統(tǒng)中藥寶庫(kù)中尋求新的抗感染研究方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株：實(shí)驗(yàn)菌株為臨床分離株，經(jīng)耐藥譜及蛋白A基因（spa）分型，編號(hào)為17546（t037）。質(zhì)控菌株為ATCC25923；均由我院臨床微生物檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2 載體：規(guī)格為1 cm×1 cm的醫(yī)用聚氯乙烯薄片（上海景年醫(yī)療器械有限公司），高壓蒸汽滅菌30 min后作為BF載體備用。

1.1.3 主要試劑：標(biāo)準(zhǔn)品黃芩苷由中國(guó)食品藥品鑒定研究院購(gòu)入，標(biāo)準(zhǔn)品頭孢他啶和克拉霉素由中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)入。M-H肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（中國(guó)陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司）；LB瓊脂、胰蛋白大豆瓊脂（TSA）（中國(guó)陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備金黃色葡萄球菌生物膜體外模型：復(fù)壯金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)菌株，取單菌落接種于含1%葡萄糖的TSB溶液20 mL中，37 ℃，200 r/min恒溫?fù)u床搖晃培養(yǎng)18～20 h后，換新鮮TSB將細(xì)菌懸液稀釋到OD600=0.1，此吸光度下對(duì)應(yīng)細(xì)菌數(shù)量約為4.75×108CFU/mL，將細(xì)菌懸液加入無菌24孔板中，每孔2 mL，再置入滅菌的BF載體，37 ℃恒溫培養(yǎng)，隔天換新鮮TSB培養(yǎng)液，3 d后于載體表面可形成早期生物膜。

1.2.2 結(jié)晶紫染色法半定量細(xì)菌生物膜：把載體放入無菌生理鹽水中輕輕漂洗后晾干，以除去浮游菌；將晾干的載體用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，染色時(shí)間約15 min；待充分染色后，再將載體用無菌生理鹽水漂洗至液體清亮，以洗去結(jié)晶紫。晾干載體后，取95%乙醇1 mL將附著于載體上的結(jié)晶紫溶出，作用時(shí)間約5 min；最后取200 μL乙醇結(jié)晶紫溶液置于96孔板內(nèi)，于分光光度計(jì)下測(cè)定OD570值。

1.2.3 MIC測(cè)定：依據(jù)2015年版CLSI，以試管2倍稀釋法測(cè)定上述藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌、質(zhì)控菌的MIC和MBC。

1.2.4 藥物對(duì)細(xì)菌生物膜的影響：將各組載體分入空白對(duì)照組、克拉霉素組、黃芩苷組、頭孢他啶組、黃芩苷+頭孢他啶組、克拉霉素+頭孢他啶組，黃芩苷、克拉霉素和頭孢他啶的最終濃度分別為512 μg/L、32 μg/L和256 μg/L;；各組載體經(jīng)無菌生理鹽水漂洗后，于建模3 d后，置入各組TSB中，每組TSB分別含上述相應(yīng)濃度藥物，于37 ℃細(xì)菌孵育箱內(nèi)孵育，分別在實(shí)驗(yàn)的第4、8、16和24小時(shí)后取出載體，將載體置入2 mL無菌生理鹽水內(nèi)，經(jīng)超聲震蕩（15 min）與旋渦震蕩儀振蕩（5 min，3000 r/min），將生物膜及生物膜內(nèi)的金黃色葡萄球菌震蕩脫落，形成菌懸液，將菌懸液以連續(xù)稀釋法行活菌計(jì)數(shù)，各組在各時(shí)間點(diǎn)均計(jì)數(shù)6份標(biāo)本，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果用±s表示。每次測(cè)定均重復(fù)3次并取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：OD570值及懸浮液活菌計(jì)數(shù)值用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA分析）。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷、頭孢他啶、克拉霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC及MBC測(cè)定結(jié)果：黃芩苷、頭孢他啶、克拉霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株（S.a-17546）的MIC分別為2048 μg/L、64 μg/L、128 μg/L，頭孢他啶對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的MBC為256 μg/L。

2.2 不同藥物組中細(xì)菌生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果：24 h內(nèi)空白對(duì)照組的BF內(nèi)活菌數(shù)無明顯變化（P＞0.05），且單藥組（黃芩苷組ā克拉霉素組和頭孢他啶組）細(xì)菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。聯(lián)用組（黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組、克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組）與空白對(duì)照組相比，第8、16、24小時(shí)生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)均明顯降低（P＜0.01），且黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組于第24小時(shí)活菌數(shù)低于克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組（P＜0.05），見表1。

表1 空白對(duì)照組、單藥組和聯(lián)用組中細(xì)菌生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（±s，lgCFU/mL）

表1 空白對(duì)照組、單藥組和聯(lián)用組中細(xì)菌生物膜內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（±s，lgCFU/mL）

注a：與空白對(duì)照組相比，P＜0.01；b：黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組與克拉霉素聯(lián)合頭孢他啶組相比，P＜0.05

空白對(duì)照組 7.871±0.201 7.598±0.391 7.844±0.288 7.860±0.335黃芩苷組 7.892±0.174 7.750±0.307 7.715±0.371 7.705±0.432克拉霉素組 7.902±0.240 7.739±0.397 7.723±0.357 7.812±0.349頭孢他啶組 7.858±0.140 7.436±0.554 7.514±0.381 7.557±0.531黃芩苷+頭孢他啶組 7.913±0.131 6.901±0.180a 6.303±0.507a 5.882±0.321a,b克拉霉素+頭孢他啶組 7.897±0.177 6.749±0.245a 6.437±0.419a 6.305±0.471a,b

表2 空白對(duì)照組、單藥組和聯(lián)用組細(xì)菌生物膜結(jié)晶紫半定量測(cè)定結(jié)果（±s）

表2 空白對(duì)照組、單藥組和聯(lián)用組細(xì)菌生物膜結(jié)晶紫半定量測(cè)定結(jié)果（±s）

注a：與空白對(duì)照組相比，P＜0.01

空白對(duì)照組 2.505±0.186 2.190±0.626 2.432±0.173 2.554±0.199黃芩苷組 2.503±0.213 2.351±0.118 2.498±0.240 1.824±0.113a克拉霉素組 2.479±0.188 1.935±0.261 2.428±0.194 1.784±0.116a頭孢他啶組 2.527±0.230 2.010±0.149 2.352±0.191 2.174±0.196黃芩苷+頭孢他啶組 2.482±0.210 1.992±0.207a 1.195±0.498a 0.672±0.246a克拉霉素+頭孢他啶組 2.540±0.236 1.909±0.301a 1.329±0.458a 0.875±0.335a

2.3 細(xì)菌生物膜經(jīng)結(jié)晶紫染色半定量法測(cè)定結(jié)果：空白對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)吸光度值無明顯變化（P＞0.05）；在單藥組中，頭孢他啶組與空白對(duì)照組吸光度值相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；黃芩苷組和克拉霉素組吸光度值于第24小時(shí)低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。在聯(lián)用組（黃芩苷+頭孢他啶組ā克拉霉素+頭孢他啶組）中，兩組吸光度均從16 h開始低于空白對(duì)照組（P＜0.01），見表2。

3 討 論

S.a是臨床常見致病菌，近年來隨著醫(yī)源性植入物及侵入性操作的增多，S.a引起的細(xì)菌生物膜相關(guān)性感染也日益增多。細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌黏附于植入物或黏膜表面后，與細(xì)菌自身分泌的多糖、脂蛋白，以及機(jī)體產(chǎn)生的纖維蛋白等相互粘連聚集，最終形成的膜狀物。其形成、發(fā)展與成熟受密度感應(yīng)系統(tǒng)（QS）調(diào)控，主要的兩種QS系統(tǒng)為agr系統(tǒng)和sar系統(tǒng)，agr系統(tǒng)通過影響胞間多糖黏附素（PIA）的生成來調(diào)控細(xì)菌間相互黏附能力，進(jìn)而影響生物膜形成。而sar系統(tǒng)一方面可以調(diào)控agr系統(tǒng)的表達(dá)，影響PIA形成，也能獨(dú)立發(fā)揮作用[5]。

我國(guó)具有豐富中草藥資源，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療感染方面為國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者開拓了新的思路，希望能從天然藥物中開發(fā)出抗菌效果好、不良反應(yīng)低的中藥[6]，黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，本課題組前期已經(jīng)證實(shí)黃芩活性成分可在體外及體內(nèi)抑制生物膜的形成[7-8]，推測(cè)其機(jī)制可能與黃芩苷抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)有關(guān)。

本研究中，黃芩苷與克拉霉素終濃度均未達(dá)其MIC，不表現(xiàn)出抑菌或殺菌作用，故黃芩苷組與克拉霉素組中BF載體，其活菌計(jì)數(shù)與空白對(duì)照組無明顯差別（P＜0.05），而24 h后結(jié)晶紫半定量法測(cè)定的吸光度值均小于空白對(duì)照組（P＜0.01），提示黃芩苷或克拉霉素在該濃度下雖不能直接殺滅細(xì)菌，但能影響生物膜的形成。

在黃芩苷或克拉霉素與頭孢他啶聯(lián)合應(yīng)用后，聯(lián)合應(yīng)用組的結(jié)晶紫半定量法測(cè)定的吸光度值在16 h、24 h均低于空白對(duì)照組（P＜0.01），而活菌計(jì)數(shù)值則在第8 h便低于空白對(duì)照組，且延長(zhǎng)作用時(shí)間，在16 h、24 h時(shí)，黃芩苷聯(lián)合頭孢他啶組的活菌計(jì)數(shù)值不僅低于空白對(duì)照組，也低于頭孢他啶聯(lián)合克拉霉素組。說明黃芩苷和克拉霉素均能在遠(yuǎn)低于其MIC的濃度下，早期破壞金黃色葡萄球菌生物膜，為頭孢他啶清除細(xì)菌提供了條件。且黃芩苷隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，其對(duì)頭孢他啶的增效作用更加明顯。

本實(shí)驗(yàn)中頭孢他啶組，其濃度等于其MBC，但其活菌計(jì)數(shù)值與結(jié)晶紫半定量法所測(cè)定的吸光度值，與空白對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在該濃度下，細(xì)菌生物膜的合成未受影響。本結(jié)果與藥敏實(shí)驗(yàn)的差異，推測(cè)與細(xì)菌生物膜的存在有很大關(guān)系，這可能也是臨床工作中，對(duì)頭孢他啶藥敏實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為敏感的金黃色葡萄球菌菌株，在臨床應(yīng)用中效果不佳的緣故。

以上研究結(jié)果表明，黃芩苷可以在低濃度下破壞金黃色葡萄球菌生物膜，與頭孢他啶有協(xié)同增效作用，且增效作用隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，可能對(duì)未來開發(fā)新的抗菌藥物提供新思路。

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