白細(xì)胞介素-6對皮質(zhì)發(fā)育障礙大鼠癇性放電的影響

李籌忠 高方友* 孫杰

(1貴州省人民醫(yī)院神經(jīng)外科; 2貴航300醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 貴陽 550000)

皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformations of cortical development, MCD)又被稱為皮質(zhì)發(fā)育畸形及皮質(zhì)發(fā)育不良等。是一類神經(jīng)發(fā)育不良疾病的總稱，是難治性癲癇和精神發(fā)育遲滯的主要病因。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia, MCD)和結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)是最常見的伴發(fā)藥物難治性癲癇的兩類MCD，具有相同的病理學(xué)特征，也是研究 MCD 致癇機(jī)制常用的疾病模型[1]。引起其致癇的主要原因?yàn)镸CD病灶中的異構(gòu)神經(jīng)元具有典型的過度興奮性，甚至可自發(fā)產(chǎn)生癇樣放電活動(dòng)[2]。皮質(zhì)發(fā)育障礙是難治性癲癇的重要病因之一，目前機(jī)制尚不完全明確。

近年一些研究提示，免疫炎癥反應(yīng)在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，細(xì)胞免疫和體液免疫均參與其中，相應(yīng)的抗炎和免疫抑制在一定程度上有效治療也驗(yàn)證了其存在性[3]。一些促炎性細(xì)胞因子在癲癇發(fā)作可能會(huì)啟動(dòng)炎性信號(hào)通路，從而擴(kuò)大與加劇癲癇的發(fā)作[3]。IL-6是主要的促炎性細(xì)胞因子之一，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用。廣泛參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，可直接或間接影響神經(jīng)元的分化、發(fā)育與功能[4]。IL-6在皮層發(fā)育障礙中起著什么樣的作用仍然不甚清楚。因此，本研究建立皮層發(fā)育障礙大鼠模型，采用匹羅卡品誘導(dǎo)癇性放電，觀察IL-6對癇性放電的影響作用。

材料與方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠孕鼠，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。新出生的幼鼠在進(jìn)行皮層冷凍模型后，置于無特定病原體(specific pathogen free, SPF)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，室內(nèi)溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，光/暗周期為12 h/12 h。所有實(shí)驗(yàn)均得到遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意，以及按照國家動(dòng)物與使用條例進(jìn)行。

二、方法

1.MCD模型制備與分組：對新出生SD大鼠行腦皮質(zhì)板局部冰凍損傷，以制備MCD動(dòng)物模型[5]。首先使用低溫麻醉，行頭皮正中切口，暴露新生鼠大腦皮層組織，將液氮浸泡的低溫T型銅針放在靠近正中線的額頂葉皮質(zhì)表面，時(shí)間約持續(xù)10 s。然后進(jìn)行逢合，復(fù)溫，待幼鼠復(fù)蘇后，回籠由母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組、匹羅卡品組、匹羅卡品+IL6注射組3個(gè)組。

2.皮層腦電埋置與記錄：取鼠齡為4 w的MCD模型鼠，在水合氯醛淺麻醉狀態(tài)下，在冰凍部位置入皮層腦電記錄電極。然后在電極附近埋置注射管，并且連接塑膠管，以進(jìn)行IL-6藥物注射。然后用牙科水泥將電極固定在頭顱上。術(shù)后1 w，待動(dòng)物習(xí)慣頭部電極后，使用RM6420多通道腦電記錄儀記錄皮層腦電(成都儀器廠)。見圖1。

3.MCD匹羅卡品模型誘導(dǎo)與IL-6的作用：實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為MCD模型誘導(dǎo)組和MCD模型誘導(dǎo)加IL-6注射組，每組8只。給予實(shí)驗(yàn)組大鼠氯化鋰腹腔注射(180 mg/kg)，18 h后給予硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，20 min后再給予20 mg/kg匹羅卡品腹腔注射。IL-6注射組給予IL-6劑量為1 μg/g。5 min內(nèi)注射完。

4.動(dòng)物行為評價(jià)：觀察模型鼠的意識(shí)狀態(tài)(清醒、嗜睡、昏睡、昏迷)、生活能力(運(yùn)動(dòng)、攝食、飲水、生育)、行為表現(xiàn)(抽搐發(fā)作、是否活動(dòng)增多及興奮躁動(dòng)、攻擊行為等)。PTZ或生理鹽水腹腔注射后，根據(jù)Bonan等[6]發(fā)作分級量表：0級，正常無癲癇發(fā)作；1級，耳朵和面部抽搐，活動(dòng)過度；2級，身體抽搐起伏，搖頭、凝視、震顫等；3 級，前肢陣攣，后肢肌陣攣樣抽搐；4級，向側(cè)面翻轉(zhuǎn)、流涎；5 級，翻轉(zhuǎn)到背面朝下，伴全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作，癲癇持續(xù)狀態(tài)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)數(shù)資料組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

結(jié) 果

一、動(dòng)物行為學(xué)觀察

所有實(shí)驗(yàn)組大鼠注射匹魯卡品后5～8 min出現(xiàn)眨眼、節(jié)律性咀嚼動(dòng)作。10 min后出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭，約30 min后出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作。

二、潛伏期電生理比較

皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組潛伏期為(25.93±1.33)min；皮層發(fā)育不良加IL-6后匹羅卡品組潛伏期為(31.05±2.35)min；與皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組相比，增加IL-6注射組后潛伏期時(shí)間明顯延長，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

三、SE期持續(xù)時(shí)間

皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組SE放電典型持續(xù)時(shí)間為(34.58±1.02) s；皮層發(fā)育不良加IL-6后匹羅卡品組潛伏期為(17.75±1.94) s；與皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組相比，增加IL-6注射組后持續(xù)時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3、4)。

四、自發(fā)性放電次數(shù)

皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組自發(fā)性癲癇放電次數(shù)為(28.83±4.26)次/只；皮層發(fā)育不良加IL-6后匹羅卡品組自發(fā)性癲癇放電次數(shù)為(12.00±3.03)次/只；與皮層發(fā)育不良加匹羅卡品組相比，增加IL-6注射后自發(fā)性放電次數(shù)明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P<0.01，圖5)。

圖1 皮層腦電埋置大鼠

Fig 1 Rats were subjected to cortical EEG

圖2 IL-6對皮層發(fā)育障礙誘發(fā)的癲癇潛伏期電生理影響

Fig 2 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

aP<0.05,vsMCD-pilocarpine.

圖3 皮層腦電圖

Fig 3 Cortical electroencephalogram

A: MCD+pilocarpine; B: MCD-pilocarpine+IL-6.

圖4 IL-6對皮層發(fā)育障礙誘發(fā)的癲癇持續(xù)時(shí)間電生理影響

Fig 4 The duration time effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

圖5 IL-6對皮層發(fā)育障礙誘發(fā)的自發(fā)性放電生理影響

Fig 5 The effect of IL-6 on MCD induced by pilocarpine

aP<0.01,vsMCD-pilocarpine.

討 論

很多癲癇病患者通過藥物控制可以得到有效治療和恢復(fù)，但超過1/4的癲癇患者在多種藥物治療的情況下，癲癇發(fā)作癥狀仍不能得到有效控制，稱之為難治性癲癇[1]。在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中，常伴隨著神經(jīng)回路重構(gòu)、突觸重塑等病理改變。近年來發(fā)現(xiàn)，癲癇這些病理改變與炎癥因子變化密切相關(guān)，炎癥因子在癲癇發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7]。

IL-6是主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌的具有多種炎性作用的細(xì)胞因子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)，無論在生理?xiàng)l件還是一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理?xiàng)l件下，都可以檢測到一定量IL-6的存在。CNS中的IL-6主要由膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生[8]?；趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床病例的研究表明，癲癇發(fā)作持續(xù)狀態(tài)后，患者腦脊液或者血漿中可以立即檢測到IL-6含量升高[9]。另有臨床標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在MCD(Ⅱ 型)患者與多發(fā)性節(jié)結(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)患者手術(shù)標(biāo)本中明顯高表達(dá)，患者癲癇發(fā)作后的血漿和腦脊液中，人可溶性白細(xì)胞介素6受體(human soluble interleukin 6 receptor, sIL-6R)的含量顯著升高，并且與進(jìn)一步分子水平的研究通過采用Western Blot和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在TSC和MCD病灶中，白細(xì)胞介素-6(IL-6)的蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于病灶周圍正常腦組織[10]。這些研究提示，IL-6信號(hào)因子或IL-6轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的分子可能參與MCD癲癇的發(fā)生或發(fā)展過程[10]。但是對IL-6對在體MCD的功能研究仍然不甚清楚。

我們的研究顯示，IL-6注射后可以有效延長潛伏期時(shí)間，說明IL-6可以降低癲癇發(fā)作的閾值。有研究證實(shí),IL-6敲除小鼠顯著增加戊四氮(pentylenetetrazole, PTZ)、N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-d-aspartate, NMDA)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(alpha-amino-3 hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate, AMPA)和紅藻氨酸(kainic acid, KA)癲癇敏感性。結(jié)合這些數(shù)據(jù)說明，IL-6在癲癇發(fā)作中可能起著保護(hù)作用。同樣，在皮質(zhì)發(fā)育障礙動(dòng)物模型中，IL-6同樣可以降低癲癇敏感性。細(xì)胞因子的主要功能是作為免疫系統(tǒng)介導(dǎo)體，是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，細(xì)胞因子可以是促炎或抗炎[11]。即使這種情況是發(fā)生在亞臨床或出現(xiàn)在出生時(shí)，由炎癥級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元變性，對腦組織神經(jīng)毒性作用，并導(dǎo)致癲癇發(fā)作和發(fā)展。

另有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠IL-6敲除后，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一些興奮性神經(jīng)遞質(zhì)更容易激活。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-6后可以減少癲癇持續(xù)時(shí)間與自發(fā)性癲癇行為學(xué)的發(fā)生,說明IL-6在癲癇過程中起著保護(hù)作用。這可能與IL-6能夠抑制其它炎癥因子等有關(guān)[10]。并且有體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，IL-6的慢性刺激可以降低II型代謝型谷氨酸受體和L-型鈣通道[12]。我們推測，IL-6對癲癇的功能可能涉及到一些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響到興奮性神經(jīng)元與抑制性神經(jīng)元的調(diào)控。但是具體影響因子仍然需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

另外，IL-6的功能也有不同的研究結(jié)論。如有研究卻證實(shí)，IL-6對培養(yǎng)中的神經(jīng)發(fā)育以及對NMDA刺激反應(yīng)過程中有損害作用，提示IL-6對神經(jīng)的影響功能是致炎作用，而非抗炎效應(yīng)[13]。由此可見，IL-6的功能定位目前并不能完全明確，在不同的條件下起著不同的作用，有的作用下有明顯的保護(hù)作用，有的情況下起著惡性作用。

總之，我們通過皮層內(nèi)注射方法，觀察IL-6可以有效減少M(fèi)CD模型癲癇放電持續(xù)時(shí)間與自發(fā)性行為學(xué)的發(fā)生，提示IL-6起著一定的保護(hù)作用。但由于多種因素，IL-6信號(hào)因子在MCD的功能和介導(dǎo)作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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