可吸收血流導(dǎo)向支架對兔動脈瘤及正常分支的長期作用

燕魯濱 盧培剛 王奎重 郝振強(qiáng) 王天助 劉慧

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濟(jì)南 250000)

顱內(nèi)動脈瘤系顱內(nèi)動脈壁的異樣突起，在臨床疾病中異常兇險(xiǎn)，本病破裂出血的患者約1/3在就診前死亡，1/3死于醫(yī)院內(nèi)，1/3經(jīng)過治療得以生存。血流導(dǎo)向支架(flow diverting stent, FDS)作為一種血管內(nèi)治療顱內(nèi)動脈瘤的裝置，在臨床上應(yīng)用十分廣泛。

FDS在治愈顱內(nèi)動脈瘤的同時引發(fā)了一系列的并發(fā)癥，包括載瘤動脈的狹窄、分支動脈的閉塞、顱內(nèi)出血等。因此，探尋一種安全、有效的FDS成為熱點(diǎn)。目前可吸收血流導(dǎo)向支架(biodegradable flow diverting stents, BFDS)在臨床上無相關(guān)報(bào)道，僅僅停留在動物實(shí)驗(yàn)階段，前期我們在利用BFDS治療兔動脈瘤上收到了預(yù)期效果[1]，隨著時間的推移，BFDS的療效有待驗(yàn)證。在現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)中，我們將BFDS置入兔體內(nèi)，觀察長期(6個月、12個月)動脈瘤的閉塞情況及其對載瘤動脈、分支動脈的影響。

材料與方法

一、材料

金屬裸支架(含22根鎳鈦合金絲、2根含顯影鉑金絲，上海微創(chuàng)醫(yī)療器械公司)、可吸收外科縫線[商品名：聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)縫合線(金杰)，8-0 PGA縫合線，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品公司，產(chǎn)品批號為18Q1219A]、新西蘭成年大白兔(體重2.0～2.5 kg，雌雄不限)、鹽酸賽拉嗪注射液注射液(商品名：陸眠寧，商品批號151218，吉林省華牧動物保健品公司)、1%的戊巴比妥鈉生理鹽水溶液、彈性蛋白酶溶液(寧波林葉生物科技公司的彈性蛋白酶粉劑，生產(chǎn)批號為150701，生物活性≥100 U/mg；將該粉劑1 g加入100 mL生理鹽水中最終配制成1 U/L彈性酶生理鹽水溶液)、注射用青霉素鉀(1.0 g 160萬單位，哈爾濱摩天農(nóng)科獸藥有限公司，生產(chǎn)批號為20150701)、生理鹽水、2%鹽酸利多卡因注射液、普通手術(shù)剪刀、鑷子、眼科剪、眼科鑷、眼科撐開器、彎鉗、止血鉗、小型止血電凝、自制泡沫手術(shù)臺(X線穿透效果好)、蔡司顯微鏡、電子秤、手提式壓力蒸汽滅菌器、24G靜脈留置針、無菌清創(chuàng)縫合包、醫(yī)用無菌手套、自制弧形動脈瘤夾子(圖2)、注射器、數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography, DSA)機(jī)器、鋼球(直徑為0.80 cm)、肝素水(50 U/mL)、泛影葡胺造影劑、阿司匹林腸溶片(25 mg/片)、硫酸氫氯吡格雷片(25 mg/片)、血管夾、5F的股動脈鞘、超滑導(dǎo)絲、導(dǎo)引導(dǎo)絲、4F單彎造影管、導(dǎo)引導(dǎo)管、微導(dǎo)絲、Y閥2個、三通2個、扭空器、導(dǎo)引閥、塑形針、組織固定液(10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林固定液，濟(jì)南百博生物科技股份有限公司)、磷酸緩沖鹽溶(phosphate buffer saline, PBS)、二甲苯、Weigert氏間苯二酚品紅試劑、CD34抗體、αSMA抗體、掃描電鏡(齊魯工業(yè)大學(xué)分析測試中心)、導(dǎo)電膠布、石蠟切片機(jī)、干燥箱。

二、方法

1.BFDS制作過程：在顯微鏡下將24根PGA縫合線編入金屬裸支架中，12枚BFDS消毒備用(圖1)。

2.兔動脈瘤的制備過程：①分離出右頸總動脈(right common carotid artery, RCCA)起始部、部分右鎖骨下動脈(right subclavical artery, RSCA)及兩者分叉處(圖2A)。②RCCA起始部2.5 cm處行遠(yuǎn)心端結(jié)扎，起始部1.5 cm只繞一個結(jié)而不結(jié)扎，動脈瘤夾夾在RCCA起始部和部分RSCA上，確保動脈瘤夾內(nèi)側(cè)緣在RCCA和RSCA連接處(圖2B)。③近心端線節(jié)打緊，且在該線節(jié)與動脈瘤夾RCC殘腔內(nèi)注入1 mL彈性蛋白酶(圖2C)，消化20 min后拔除套管針，結(jié)扎RCCA 穿刺口處，小心松開動脈瘤夾，發(fā)現(xiàn)RCCA殘腔的血管壁透明(圖2D)。

圖1 顯微鏡下BFDS(標(biāo)尺刻度=1 mm)

Fig 1 BFDS under the microscope (one division of the ruler=1 mm)

圖2 動脈瘤的制備過程

Fig 2 The process of making the aneurysmal models

A: The crotch between the RSCA and the RCCA (the blue arrowhead represented RSCA, the black arrowhead represented the RCCA; the green arrowhead represented the pneumogastric nerve; the yellow arrowhead represented the jugular vein); B: The location of aneurismal clip; C: Injecting the elastase into the RCCA; D: The RCCA after the injection of elastase.

3.靜脈造影(intravenous digital subtraction angiography, IVDSA)篩查：造模后6 w，兔麻醉后，左側(cè)耳緣靜脈留置針連接高壓注射器，以1.5 mL/s，總量5 mL的造影劑量行IVDSA(造影劑經(jīng)過右耳緣靜脈、右頸靜脈、肺循環(huán)、左心室、主動脈弓、無名動脈、動脈瘤)篩選出制備成功的動脈瘤模型12只。

4.動脈造影(arterial digital subtraction angiography, DSA)及支架的置入：兔麻醉、分離出股動脈后，股動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎、近心段繞線不打結(jié)，兩者間血管夾臨時阻斷血管，在遠(yuǎn)心端線結(jié)和血管夾之間剪開側(cè)口后，超滑導(dǎo)絲引導(dǎo)5F鞘插入股動脈近端并留置鞘在股動脈內(nèi)(圖3)。兔肝素化后，5F導(dǎo)引導(dǎo)管在超滑導(dǎo)絲導(dǎo)引下進(jìn)入無名動脈，行DSA及3D DSA檢查，觀察動脈瘤的形態(tài)、大小及載瘤動脈直徑(表1)。撤出超滑導(dǎo)絲，微導(dǎo)管在微導(dǎo)絲的指引下進(jìn)入無名動脈跨過瘤頸部到達(dá)右椎動脈遠(yuǎn)端，邊撤微導(dǎo)管、邊撤導(dǎo)絲，使支架展開后覆蓋瘤頸部、右椎動脈開口處。隨后將導(dǎo)引導(dǎo)管撤至腹主動脈處行DSA造影并將支架放置在腹主動脈(abdominal aortas, AA)覆蓋分支腰動脈開口處(圖4 A～C)。所有兔子在術(shù)前3 d、術(shù)后10 d給予雙抗療法(阿司匹林+硫酸氫氯吡格雷)預(yù)防血栓形成。

5.掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)與病理：兔子飼養(yǎng)12個月后，過量戊巴比妥鈉(≥ 100 mg/kg)麻醉后，用組織固定液約50 mL進(jìn)行心臟灌注。在顯微鏡下仔細(xì)分離出動脈瘤、載瘤動脈、主動脈弓、腹主動脈及腰動脈，最后將沖洗干凈的標(biāo)本組織固定液內(nèi)浸泡至少24 h。將所有標(biāo)本用導(dǎo)電膠布固定到掃描電鏡固定臺上，進(jìn)行噴金以增強(qiáng)掃描圖片顯示效果，低真空(40 Pa)模式下觀察瘤頸部愈合情況和腰動脈開口內(nèi)膜增生情況(圖5)。顯微鏡下挑凈支架后行石蠟包埋(動脈瘤和載瘤動脈長軸與將要切片面平行；腰動脈和腹主動脈長軸與將要切片面平行)，然后在切片機(jī)下切成5 μm薄片后所有標(biāo)本行常規(guī)HE染色、CD34及αSMA 免疫組織化學(xué)染色：①H-E染色的大體步驟為：兩種二甲苯脫蠟；梯度酒精脫水；染色；中性樹膠封片。②Weigert氏間苯二酚品紅試劑染色大體步驟為：石蠟切片3～5 μm，脫蠟至95%酒精溶液中；該染液染色1～2 h或更長時間；切片從染液取出后直接用95%酒精洗去多余染液，分化至無余色；充分水洗5 min。③免疫組化染色的大體步驟為：切片脫蠟，過氧化氫孵育10 min；蒸餾水沖洗，山羊血清孵育10 min后傾去血清；PBS沖洗多次；添加一抗、PBS沖洗多次后添加二抗、顯色劑顯色；水沖洗后、復(fù)染、封片。

動脈瘤、載瘤動脈、腰動脈開口處直徑等各項(xiàng)參數(shù)測量均根據(jù)DSA機(jī)器參照鋼球直徑測量出。

圖3 動脈瘤兩種不同支架置入

Fig 3 Aneurysms treated by the BFDS and MFDS

A: DSA showed a saccular aneurysm; B: 3D DSA showed a saccular aneurysm; C: The process of implanting the BFDS; D: The aneurysm was completely occluded by IVDSA after 6 months; E, F: The aneurysm was completely occluded by DSA and 3D DSA after 6 months; G: The aneurysm specimen; H: DSA showed a saccular aneurysm; I: The residual aneurysm less than 50% by IVDSA after 1 year.

A～G: Experimental group; H～I(xiàn): Control group.

圖4 腹主動脈支架置入過程

Fig 4 The abdominal aortas treated by the BFDS

A: The lumbar was clear before implanting the BFDS; B: The lumbar was clear at the moment of implanting the BFDS; C: The lumbar was clear after implanting the BFDS in one year's follow-up.

結(jié) 果

一、影像學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

FDS置入前，動脈瘤各項(xiàng)參數(shù)(瘤高、瘤寬、瘤頸寬)及PA直徑在兩組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。腰動脈開口處的直徑在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

FDS置入后12個月后，結(jié)合Kamran分級得出兩組之間動脈瘤完全閉塞率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2)。結(jié)合分支動脈閉塞情況評分，兩組腰動脈開口處閉塞情況在兩組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表3)。

二、掃描電鏡及病理結(jié)果

FDS置入后12個月后，動脈瘤瘤頸部完全被新生內(nèi)膜覆蓋，新生內(nèi)膜內(nèi)主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌纖維、彈性纖維及膠原纖維組成。腰動脈開口處被部分新生內(nèi)膜覆蓋，新生內(nèi)膜主要血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌纖維、膠原纖維組成(圖5)。

圖5 12個月后實(shí)驗(yàn)組的掃描電鏡、病理結(jié)果圖片

Fig 5 Photographs of SEM and pathological results in the experimental group after 12 months

A: The neointima covered the neck of aneurysm completely under the microscope and SEM; B: The neointima covered the neck of aneurysm completely under the microscope and SEM (×100); C, D: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly under the microscope; D: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly under SEM; E: The neointima (the blue arrowhead) covered the neck of aneurysm completely and surrounded the small hole (H&E, remove of the metal struts produced the small hole); F: CD34-positive endothelium cells (blue) were located at the surface of the neointima; G: α-SMA positive endothelium cells (brown) were located at the surface of the neointima; H: The neointima contained the elastic fibers (blue) and the collagenous fiber (red) (Weigert); I: The neointima covered at the edge of the lumbar artery ostium partly (the blue arrowhead) (H&E); J: CD34-positive endothelium cells (blue) were located at the surface of the neointima; K: α-SMA positive endothelium cells (brown) were located at the surface of the neointima; L: The neointima contained the elastic fiber (red) (Weigert).

Bar=1 mm in Fig A.

GroupHeightWidthNeckPAdiameter BFDS0．40±0．21a0．27±0．15a0．35±0．14a0．30±0．13a MFDS0．30±0．260．18±0．160．25±0．050．20±0．15

aP<0.05,vsMFDS group.

表2 動脈瘤的完全閉塞率 [n(%)]

Tab 2 Complete occlusion ratio of aneurysm [n(%)]

GroupCompleteocclusionNon?completeocclusionn Completeocclusion(%) BFDS6(100)a0(0)6100 MFDS1(20)4(80)5b20 Total741163．6

aP<0.05,vsMFDS group; b represents the dead rabbit (excluded).

表3 腰動脈開口處閉塞情況評分[n(%)]

Tab 3 Block rating of the lumbar artery ostium [n(%)]

Groupn1point2points3points4points BFDS63(50)a2(33)a1(17)a0(0)a MFDS50(0)1(20)1(20)3(60)

aP<0.05,vsMFDS group.

討 論

關(guān)于模型動物的選擇，雖然兔頸動脈形態(tài)學(xué)和人血管差距大，但是頸動脈直徑與大腦中動脈起始部相似，而且，相對于其他哺乳動物，兔子凝血系統(tǒng)與人最相似[2-3]。在我們的實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用Wang等[4]提出的動脈瘤夾臨時夾閉結(jié)合彈性蛋白酶誘導(dǎo)制作兔動脈瘤模型，該動脈瘤模型與人類動脈瘤具有相似組織學(xué)和血流動力學(xué)特點(diǎn)，并且動脈瘤的形成至少需要21 d。兩組兔子12個月后，動脈瘤瘤頸部發(fā)現(xiàn)新生內(nèi)膜，且新生內(nèi)膜成分有血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌纖維組成。Ding等[5]報(bào)道了兔動脈瘤模型在制作5年后依然沒有發(fā)生動脈瘤的自然閉塞，這給我們在1年以上的時間內(nèi)排除了動脈瘤“自愈”原因引起的動脈瘤的閉塞。對于實(shí)驗(yàn)組除了死亡的1只外，在6個月、12個月的隨訪中行DSA造影復(fù)查動脈瘤閉塞均達(dá)到4級；對照組在6個月、12個月隨訪中行DSA復(fù)查動脈瘤閉塞達(dá)到4級的僅有1只。

Masuo等[6]在認(rèn)為人類顱內(nèi)分支動脈類似兔腰動脈，在金屬支架置入腹主動脈的三個月的隨訪中證實(shí)了腰動脈的通暢性。Hong等[7]在研究血流導(dǎo)向支架金屬覆蓋率與分支動脈口新生內(nèi)膜的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)：在支架置入即刻或后期影像學(xué)隨訪中未發(fā)現(xiàn)分支動脈的閉塞。在掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)，靠近分支動脈口附近的支架和網(wǎng)孔布滿新生內(nèi)膜，但是在分支動脈口中央位置僅有少量纖維蛋白覆蓋支架上。在我們12個月的隨訪中發(fā)現(xiàn)，腰動脈開口處確實(shí)有內(nèi)膜增生，而且內(nèi)膜增生較Hong實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，但并不是內(nèi)膜增生僅限于分支開口周圍的支架和網(wǎng)孔，而是雜亂無章的，病理結(jié)果也證實(shí)了覆蓋腰動脈開口處的成分是增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及膠原纖維。但兩者一致的是DSA在6個月、12個月復(fù)查時未發(fā)現(xiàn)腰動脈顯影不良，因此在BFDS對分支血管的長期影響上來說是有的，但是這個影響僅僅是量變，不會引起質(zhì)變(分支動脈的完全閉塞，影響血流灌注)。

在Becske等[8]報(bào)道過FDS置入載瘤動脈后發(fā)生載瘤動脈內(nèi)血栓形成，狹窄的概率是1.9%。在我們剪開載瘤動脈時發(fā)現(xiàn)在支架的管腔內(nèi)有新生內(nèi)膜的覆蓋，PGA縫合線已經(jīng)完全降解，HE染色可見PGA降解后殘留的空隙，免疫組化顯示新生內(nèi)膜由大部分的αSMA染色陽性的平滑肌細(xì)胞和少量CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞組成。 因此我們同樣認(rèn)為在BFDS置入載瘤動脈后對載瘤動脈的影響是有限的。

理想的治療顱內(nèi)動脈瘤的支架為動脈瘤閉塞后可以完成自然降解，PGA可吸收支架在心內(nèi)科治療冠狀動脈狹窄成為熱點(diǎn)，并且證明了其可行性。當(dāng)裸金屬支架網(wǎng)絲覆蓋率達(dá)到35%可引起動脈瘤完全閉塞[9]，可以完全治愈動脈瘤。但是在血流導(dǎo)向支架置入載瘤動脈過程過由于壓縮或拉伸作用會引起金屬覆蓋率的變化[10]。但在我們的實(shí)驗(yàn)中BFDS置入載瘤動脈后支架網(wǎng)絲覆蓋率沒有進(jìn)行相關(guān)計(jì)算。

總之，F(xiàn)DS在長期(6個月、12個月)動物實(shí)驗(yàn)中證明了其治療動脈瘤的有效性，對載瘤動脈和正常血管分支的影響是較小的。

參 考 文 獻(xiàn)

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