c-Myb和PCNA在甲狀腺乳頭狀癌患者中的表達及與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

張寅，劉軍，蘇磊，桑劍鋒，姚永忠

南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院甲乳外科，南京 210008

甲狀腺癌作為一種常見的甲狀腺惡性腫瘤，目 前其發(fā)病率正以每年6.2%的速度遞增，臨床上甲狀腺癌按照組織形態(tài)分為四類，分別是甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺未分化癌以及甲狀腺髓樣癌[1-3]。其中，甲狀腺乳頭狀癌占甲狀腺癌的80%～85%，盡管其預后較好，但患者早期常會出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。c-Myb是一種核內(nèi)蛋白質(zhì)類原癌基因，對造血細胞的分化和增殖具有極其重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)其在肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤細胞中也有表達。Lee等[4]研究認為c-Myb高表達可以促進蛋白質(zhì)以及相關(guān)細胞器的合成，從而達到縮短細胞增殖周期的目的。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作為評估腫瘤惡性潛能的指標，存在于細胞核中，研究表明，其在很多腫瘤組織中都呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，因此，在腫瘤的臨床診斷治療過程中檢測c-Myb和PCNA的表達具有重要的參考價值[5]。本研究采用免疫組織化學方法檢測c-Myb和PCNA在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的表達情況，并且對c-Myb和PCNA在甲狀腺乳頭狀癌中的表達與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系進行分析，從而為臨床治療甲狀腺乳頭狀癌和判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年12月至2015年12月于南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院甲乳外科行手術(shù)治療的108例甲狀腺腫瘤患者的石蠟標本，包括60例甲狀腺乳頭狀癌石蠟標本、24例甲狀腺腺瘤石蠟標本和24例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫石蠟標本。所有患者的臨床資料完整；患者術(shù)前均未接受過任何化療、放療；患者均經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診；后續(xù)切片HE染色和病理學診斷均無誤。所有標本均采用10%的中性福爾馬林固定液固定，然后切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，制備成HE染色切片，行常規(guī)的病理學檢測診斷無誤。甲狀腺乳頭狀癌患者中，男14例，女46例；年齡21～70歲，平均（42.5±5.1）歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移33例，未轉(zhuǎn)移27例；采用2010年版美國癌癥聯(lián)合委員會的TNM分期標準[6]進行分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期20例。甲狀腺腺瘤患者中，男10例，女14例；年齡23～60歲，平均（42.5±3.8）歲。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者中，男8例，女16例；年齡33～66歲，平均（42.1±5.1）歲。3組患者的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 抗體和試劑

鼠抗人c-Myb和PCNA單克隆抗體購于天津北洋百川生物技術(shù)有限公司。氯化鈉、磷酸氫二鈉等試劑購于北京百靈威有限公司。

1.3 免疫組織化學檢測方法

將石蠟進行切片，放入40%的酒精中，40℃水浴4 min，進行展開，然后置于60℃烘箱中進行烘片。采用二甲苯脫蠟20 min，然后采用梯度酒精進行水化，對c-Myb蛋白進行高溫高壓組織修復，對PCNA進行EDTA高溫修復，然后加入3%的雙氧水，室溫靜置10 min，從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗，加入5%的羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，次日取出，使用PBS沖洗，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，使用PBS沖洗，終止顯色，使用蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化，酒精脫水干燥，鏡下觀察。

1.4 免疫組化判斷標準

免疫組化染色結(jié)果表現(xiàn)為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。其中，c-Myb陽性表達于細胞質(zhì)，PCNA陽性表達于細胞核。根據(jù)染色強度評分：陰性為0分，弱陽性為1分，陽性為2分；依據(jù)陽性細胞數(shù)所占比例評分：無陽性細胞為0分；1%～25%的陽性細胞為1分；﹥25%的陽性細胞為2分。評分標準：總分為兩項評分相加；總分﹥2分為陽性，≤2分為陰性[7-8]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同類型甲狀腺腫瘤組織中c-Myb和PCNA表達情況的比較

甲狀腺乳頭狀癌組織中c-Myb的陽性表達率高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，甲狀腺腺瘤組織中c-Myb的陽性表達率高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。甲狀腺乳頭狀癌組織中PCNA的陽性表達率明顯高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）；甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中PCNA的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。（表1）

表1 不同類型甲狀腺腫瘤組織中c-Myb和PCNA的表達情況[n（%）]

2.2 不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者c-Myb和PCNA表達情況的比較

c-Myb在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、包膜是否完整及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)（P﹥0.05）；PCNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達僅與患者的年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P﹤0.05）。（表2）

3 討論

影響甲狀腺乳頭狀癌的因素有很多，包括腫瘤直徑、分化程度以及是否浸潤血管等[9-10]。對于甲狀腺乳頭狀癌治療失敗的主要原因是腫瘤細胞發(fā)生了侵襲與轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的基本特征是細胞失控性的生長，包括細胞凋亡減少、增殖加快以及去分化等多個細胞生命活動[11]。因此，無論是惡性腫瘤還是良性腫瘤，都會表現(xiàn)出異常的增殖。研究表明，當腫瘤直徑﹤2 cm時，腫瘤生長較慢，原發(fā)性腫瘤只發(fā)生局部的侵襲，但未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，這就是所謂的潛伏期[12-14]。但是，當腫瘤直徑超過2 cm時，微血管開始形成，瘤體迅速增大，并且發(fā)生轉(zhuǎn)移。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，就會給臨床治療帶來困難，所以，及早發(fā)現(xiàn)并控制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移一直是醫(yī)學界不斷探索的熱點和需要攻克的難點[15-16]。有文獻報道稱c-Myb是一種參與到細胞增殖和分化的核轉(zhuǎn)錄因子，是與V-myb同源的原癌基因[17]。其異常表達常見于非造血系統(tǒng)的腫瘤組織中，如肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等，已有研究證明其與白血病的發(fā)展以及乳腺癌的擴散關(guān)系密切[18]。近期研究表明，c-Myb表達很弱或者無表達則表明細胞處于靜止狀態(tài)，但當c-Myb表達明顯增加時，則表明細胞處于增殖狀態(tài)[19]。本研究通過檢測c-Myb在甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腺瘤以及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的表達情況發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌組織中c-Myb的陽性表達率高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，甲狀腺腺瘤組織中c-Myb的陽性表達率高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。提示c-Myb表達水平的高低在一定程度上可以反映甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展情況，其具體機制尚需進一步深入研究。而c-Myb的表達與甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床特征無關(guān)（P﹥0.05），這一結(jié)果與胡嘯玲等[20]的研究結(jié)果相似，其通過對結(jié)腸癌組織中c-Myb表達的檢測，發(fā)現(xiàn)c-Myb的陽性表達與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位和腫瘤直徑均無關(guān)（P﹥0.05）。Trendell-Smith等[21]報道，PCNA在惡性腫瘤中的表達水平高于良性腫瘤，因此，可以將PCNA作為一種判斷腫瘤良性或者惡性的指標。張正春等[22]研究表明PCNA蛋白的表達與甲狀腺腫瘤的惡性行為有關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的PCNA蛋白的陽性表達率高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。本研究通過免疫組織化學法檢測PCNA蛋白的表達，結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中PCNA的陽性表達率明顯高于甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）；但甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中PCNA的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），提示PCNA的表達與甲狀腺腫瘤的惡性行為有關(guān)。而從PCNA的表達與患者臨床特征的關(guān)系來看，PCNA的表達與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P﹤0.05），提示PCNA和甲狀腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移以及預后具有緊密的聯(lián)系。

綜上所述，c-Myb和PCNA在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用，可以將其作為一項新的檢測指標應用于甲狀腺腫瘤的臨床診斷中。但是，c-Myb的作用機制仍需進一步深入探討，一旦其作為一種新的治療靶點被發(fā)掘出來，將會極大地推動甲狀腺腫瘤治療方式的發(fā)展。目前，國內(nèi)對于PCNA的研究僅僅局限于病理學現(xiàn)象的觀察，如何將疾病的發(fā)生和PCNA的基礎研究相結(jié)合，尋找以PCNA為突破口的治療方法將是未來治療甲狀腺腫瘤又一個努力的方向。

表2 不同臨床特征甲狀腺乳頭狀癌患者c-Myb和PCNA表達情況的比較

參考文獻

[1]代文杰.甲狀腺癌規(guī)范化診斷和治療的重要性[J].臨床外科雜志,2015,23(7):485-486.

[2]閆慧嫻,谷偉軍,楊國慶,等.橋本甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌關(guān)系的臨床研究[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2014,30(4):302-306.

[3]Xiao C,Calado DP,Galler G,et al.MiR-150 controls B cell differentiation by targeting the transcription factor c-myb[J].Cell,2016,165(4):1027.

[4]Lee HY,Tae HJ,Cho GS,et al.Effect of ischemic preconditioning on the expression of c-myb in the CA1 region of the gerbil hippocampus after ischemia/reperfusion injury[J].Iran J Basic Med Sci,2016,19(6):624-631.

[5]Svandova E,Vesela B,Smarda J,et al.Mouse incisor stem cell niche and myb transcription factors[J].Anat Histol Embryol,2015,44(5):338-344.

[6]林巖松,李嬌.2015年美國甲狀腺學會《成人甲狀腺結(jié)節(jié)與分化型甲狀腺癌診治指南》解讀:分化型甲狀腺癌131Ⅰ治療新進展[J].中國癌癥雜志,2016,26(1):1-12.

[7]Li L,Chang W,Yang G,et al.Targeting poly(ADP-ribose)polymerase and the c-Myb-regulated DNA damage response pathway in castration-resistant prostate cancer[J].Sci Signal,2014,7(326):ra47.

[8]高健,高明,于洋,等.甲狀腺乳頭狀癌濾泡亞型臨床病理特征分析[J].中華普通外科雜志,2014,29(3):199-202.

[9]Yu L,Ding GF,He C,et al.MicroRNA-424 is down-regulated in hepatocellular carcinoma and suppresses cell migration and invasion through c-Myb[J].PLoS One,2014,9(3):e91661.

[10]付慶鋒,周樂,邊學海,等.甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移FNA-Tg診斷標準值的探討[J].中華內(nèi)分泌外科雜志,2013,7(2):154-156.

[11]吳干勛,陳偉,楊麗,等.彩超結(jié)合CT分區(qū)評估甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的探討[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,28(4):252-255.

[12]Pattabiraman DR,McGirr C,Shakhbazov K,et al.Interaction of c-Myb with p300 is required for the induction of acute myeloid leukemia(AML)by human AML oncogenes[J].Blood,2014,123(17):2682-2690.

[13]楊傳家,宮建,吳鋒,等.乙酰肝素酶與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].廣西科學,2015,22(1):44-47.

[14]崔秋麗,劉文英,李廣涵,等.甲狀腺乳頭狀癌超聲造影增強模式及與腫瘤侵襲性的關(guān)系探討[J].中華超聲影像學雜志,2015,24(7):580-583.

[15]俞甲子,王雅平,貝一冰,等.CN0甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素分析[J].中華普通外科雜志,2014,29(3):195-198.

[16]Goellner EM,Smith CE,Campbell CS,et al.PCNA and Msh2-Msh6 activate an Mlh1-Pms1 endonuclease pathway required for Exo1-independent mismatch repair[J].Mol Cell,2014,55(2):291-304.

[17]Tsutakawa SE,Yan C,Xu X,et al.112 Structurally distinct ubiquitin-and SUMO-modified PCNA:implications for their distinct roles in the DNA damage response[J].J Biomol Struct Dyn,2015,33 Suppl 1:70-71.

[18]Shettigar M,Savic M,Sant’Angelo DB,et al.Ubiquitylation of the Paf oncoprotein and interaction with PCNA is essential for hematopoietic stem cell function and development[J].J Immunol,2016,196(1 Suppl):52.

[19]Yu C,Gan H,Han J,et al.Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall[J].Mol Cell,2014,56(4):551-563.

[20]胡嘯玲,湯恢煥,徐海帆.結(jié)腸癌組織中PUMA和c-myb表達及其臨床病理意義[J].中國實驗診斷學,2011,15(6):1057-1060.

[21]Trendell-Smith NJ,Oates J,Crocker J.The evaluation of salivary gland tumours using proliferating cell nuclear antigen[J].J Laryngol Otol,1997,111(6):551-555.

[22]張正春,孫超,施公勝.CD44V6、PCNA、E-cadherin和EGFR在甲狀腺腫瘤中的表達[J].腫瘤基礎與臨床,2002,15(3):161-163.