miRNA-214在甲狀腺乳頭狀癌患者血清中的表達(dá)水平及臨床意義

郭輝，張斌，胡利民

天門市第一人民醫(yī)院普外科，湖北 天門 431700

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤， 發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第6位[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的一種組織學(xué)類型，PTC屬于高分化惰性腫瘤，大多數(shù)預(yù)后良好，但仍有部分患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或被膜侵犯，影響手術(shù)切除率及患者預(yù)后。因此，開展PTC相關(guān)分子生物學(xué)研究，尋找可評估PTC侵襲性、指導(dǎo)術(shù)式及評價預(yù)后的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。研究顯示，除基因重排與突變外，微小RNA（miRNA）也參與PTC的發(fā)生和發(fā)展[2]。miRNA是一種高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程[3]。由miRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控方式，miRNA突變或異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]，且與腫瘤的治療反應(yīng)、分期、預(yù)后及復(fù)發(fā)檢測密切相關(guān)[5]。miRNA-214作為miRNA家族成員之一，具有類似癌基因或抑癌基因的功能。研究證實(shí)，miRNA-214表達(dá)異常與乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估的分子標(biāo)志物[6]。外周血miRNA具有良好的穩(wěn)定性，miRNA檢測具有靈敏、便捷等優(yōu)勢，成為近年來腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[7]。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)檢測PTC及良性甲狀腺腫瘤患者的血清miRNA-214表達(dá)水平，分析其與PTC患者臨床特征的關(guān)系，旨在探討其在PTC診斷及個體化評估中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1月至2017年6月天門市第一人民醫(yī)院收治的經(jīng)術(shù)后病理檢查確診的50例PTC患者和46例良性甲狀腺腫瘤患者的臨床資料。所有患者均排除其他惡性腫瘤史，術(shù)前均未接受抗腫瘤治療。PTC患者中，男20例，女30例；年齡24～63歲，平均（43±12）歲；甲狀腺腫瘤患者中，男14例，女32例；年齡25～71歲，平均（45±14）歲；結(jié)節(jié)性甲狀腺腫31例，甲狀腺腺瘤15例。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血清采集與保存 采集患者的清晨空腹外周靜脈血4 ml，置于真空血樣采集管中，室溫靜置30～60 min，3500 r/min離心 10 min，收集上層血清于無酶EP管中，保存于-80℃醫(yī)用低溫箱。

1.2.2 血清總RNA提取 采用QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit抽提和純化標(biāo)本中的總RNA，具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。采用分光光度計檢測提取的總RNA純度及濃度，取A260/A280為1.8～2.1的樣本，置于-80℃醫(yī)用低溫箱保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄 采用QIAGEN公司的miScriptⅡRT Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系（20 μl）：5×miScript HisSpec Buffer 4 μl，10×miScript Nucleics Mix 2 μl，RNase-free water 6 μl，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl，RNA 6 μl。反應(yīng)條件：37℃、60 min，95℃、5 min。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液用RNase-free water稀釋11倍后進(jìn)行分裝，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增 采用QIAGEN公司的miScript SYBR? Green PCR Kit和miScript Primer Assays對cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miRNA-214及內(nèi)參Ce_miR-39_1的特異性引物均為QIAGEN公司專利產(chǎn)品（Assay name:Hs_miR-214_2）。反應(yīng)體系（20 μl）：2 × QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10×miScript Precursor Assay 2 μl，RNasefree water 6 μl，模板 cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃、15 min（預(yù)變性），94℃、15 （s變性），55℃、30 （s退火），共40個循環(huán)；70℃、30 （s延伸）。每個樣本設(shè)置兩個復(fù)孔，每批樣本設(shè)置1個空白對照。

1.2.5 miRNA-214相對表達(dá)量的計算 采用2-△△Ct法計算miRNA-214的相對表達(dá)量，以Ce_miR-39_1為內(nèi)參。每個標(biāo)本的Ct值取復(fù)孔均值，△Ct=C（tmiRNA-214）－C（tCe_miR-39_1），△△Ct=△Ct試驗(yàn)組－△Ct對照組，miRNA-214的相對表達(dá)量為2-△△Ct。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0和Medcalc 15.2.2軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）或中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析miRNA-214表達(dá)水平與PTC患者臨床特征的關(guān)系。繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線），分析miRNA-214對PTC的診斷效能。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC患者和良性甲狀腺腫瘤患者血清miRNA-214表達(dá)水平的比較

PTC患者的血清miRNA-214表達(dá)水平為3.798（1.856，5.094），明顯高于良性甲狀腺腫瘤患者的 1.272（0.711，2.351），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.941，P=0.003）。

2.2 血清miRNA-214表達(dá)水平與PTC患者臨床特征的關(guān)系

血清miRNA-214表達(dá)水平與PTC患者的腫瘤最大徑、被膜侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)（P﹤0.05），與患者的性別、年齡無關(guān)（P﹥0.05）。（表1）

表1 血清miRNA-214表達(dá)水平與PTC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 血清miRNA-214對PTC的診斷價值

以術(shù)后病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，血清miRNA-214診斷PTC的曲線下面積（area under curve，AUC）為 0.762（Z=5.328，P﹤0.01，95%CI：0.664～0.843）。當(dāng)Youden指數(shù)為0.478時，cut off值為3.778，靈敏度為50.00%，特異度為97.83%。（圖1）

圖1 血清miRNA-214診斷PTC的ROC曲線

2.4 血清miRNA-214對PTC侵襲、轉(zhuǎn)移的診斷價值

以術(shù)后病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)繪制ROC曲線，血清miRNA-214診斷PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.825（Z=4.228，P﹤0.01，95%CI：0.692～0.918），當(dāng)Youden指數(shù)為0.639時，cut off值為4.865，靈敏度為81.82%，特異度為82.05%。血清miRNA-214診斷 PTC 被膜侵犯的 AUC 為 0.757（Z=3.649，P﹤0.01，95%CI：0.615～0.867），當(dāng)Youden指數(shù)為0.427時，cut off值為4.103，靈敏度為75.00%，特異度為67.65%。（圖 2、圖 3）

3 討論

圖2 血清miRNA-214診斷PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

圖3 血清miRNA-214診斷PTC被膜侵犯的ROC曲線

miRNA是廣泛存在于動植物體內(nèi)，長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，能以堿基互補(bǔ)的形式特異性結(jié)合mRNA，抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或直接降解靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，從而參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡。miRNA-214是miRNA家族的重要成員，位于染色體1q24.3區(qū)域和發(fā)動蛋白超家族成員DNM3第14號內(nèi)含子上。miRNA-214為多功能miRNA，研究表明，miRNA-214在不同腫瘤中的表達(dá)水平不同，可通過調(diào)控癌基因及抑癌基因的表達(dá)水平，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[8]。外周血miRNA為最小的非侵入性分子標(biāo)志物，組織中的miRNA可經(jīng)主動分泌或被動滲漏等途徑進(jìn)入外周血。外周血miRNA具有良好的抗RNase活性[9]，且受內(nèi)源性RNA酶保護(hù)而免于降解[10]，具有較好的穩(wěn)定性和特異性，能穩(wěn)定存在于血清、唾液及尿液等體液中[11]。通過現(xiàn)代技術(shù)可在體液中檢測到病理狀態(tài)下異常表達(dá)的miRNA，這使得外周血miRNA成為潛在的無創(chuàng)性診斷、治療及預(yù)后評估的新型分子生物學(xué)標(biāo)志物。目前，血清miRNA-214已被證實(shí)可作為乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等的特異性腫瘤標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床[12]。

關(guān)于miRNA-214在惡性腫瘤中的表達(dá)水平，近年來有大量的研究。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，認(rèn)為miRNA-214在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Schwarzenbach等[14]研究報道，乳腺癌患者的外周血miRNA-214表達(dá)水平上調(diào)，miRNA-214在評價惡性指標(biāo)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散方面具有重要作用。Yang等[15]研究顯示，miRNA-214在胃癌組織及細(xì)胞中均高表達(dá)，并證明miRNA-214通過綁定PTEN的3’UTR靶點(diǎn)，負(fù)性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后水平，從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的擴(kuò)散、遷移和侵襲。另有研究表明，miRNA-214在食管癌中的表達(dá)下調(diào)，miRNA-214高表達(dá)能抑制食管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡，敲除miRNA-214后可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，并由此認(rèn)為miRNA-214是食管癌的抑癌基因[16]。

本研究通過qRT-PCR檢測PTC及良性甲狀腺腫瘤患者的血清miRNA-214表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTC患者的血清miRNA-214表達(dá)水平明顯高于良性甲狀腺腫瘤患者（P﹤0.01），ROC曲線分析證實(shí)miRNA-214可作為區(qū)分PTC與良性甲狀腺腫瘤的潛在分子標(biāo)志物，對診斷PTC具有一定的臨床價值。本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-214表達(dá)水平與PTC患者的腫瘤最大徑、被膜侵犯情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)，即腫瘤越大、存在被膜侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，miRNA-214表達(dá)水平越高，提示miRNA-214在PTC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于其他miRNA家族成員在PTC中的表達(dá)，Lee等[17]研究報道，PTC患者血漿中miRNA-155的表達(dá)較甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者或健康人群明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與PTC的侵襲性及預(yù)后不良有關(guān)。Yang等[18]研究顯示，miRNA-222-3p在PTC組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)量與存在被膜侵犯、TNM分期晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理因素密切相關(guān)，并認(rèn)為miRNA-222-3p表達(dá)異常是PTC發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素。因此，miRNA-214可作為輔助診斷PTC的新的生物學(xué)標(biāo)志物，并可用于術(shù)前臨床評估，通過調(diào)節(jié)miRNA-214的表達(dá)可以抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，為腫瘤治療提供了新思路。

盡管PTC在生物學(xué)行為上表現(xiàn)為高分化惰性腫瘤，具有相對較弱的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，腫瘤進(jìn)展慢，病死率低，但PTC常發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性較大，從而表現(xiàn)出高侵襲性，影響預(yù)后。因此，術(shù)前了解PTC的侵襲性等病理學(xué)特征對指導(dǎo)術(shù)式、術(shù)后治療及預(yù)后評估十分重要。在miRNA與PTC生物學(xué)行為關(guān)系的研究中，Yip等[19]認(rèn)為，在合并局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的侵襲性PTC患者中，miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p的表達(dá)水平較非侵襲性PTC患者明顯上調(diào)；另外一項(xiàng)研究也顯示，miRNA-221-3p、miRNA-222-3p和miRNA-146b-3p在伴有被膜侵犯的PTC組織中高表達(dá)[20]。其他研究則認(rèn)為，血清miRNA-222-3p、miRNA-146b-3p、miRNA-221-3p和miRNA-222-3p在合并有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者中表達(dá)水平更高[17,21]。本研究結(jié)果顯示，血清miRNA-214表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及被膜侵犯情況有關(guān)，且ROC曲線表明，miRNA-214在評價PTC是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或被膜侵犯方面具有診斷價值，說明術(shù)前檢測miRNA-214表達(dá)水平能預(yù)測PTC的某些病理特征及生物學(xué)行為，對術(shù)前PTC患者的個體化病情評估具有重要的指導(dǎo)意義。

綜上所述，miRNA-214在PTC患者的血清中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平能反映PTC的進(jìn)展情況，可作為術(shù)前評估PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及被膜侵犯情況的一項(xiàng)輔助指標(biāo)，并對PTC的臨床診斷具有一定價值。筆者后續(xù)將研究miRNA-214在PTC組織中的表達(dá)水平，以探究miRNA-214在PTC發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制，為miRNA-214作為新的診斷、治療及預(yù)后評估指標(biāo)提供依據(jù)。

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