緊密連接相關(guān)蛋白在肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤中的表達及臨床意義

鄢少聰，應學明

景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院腫瘤科，江西 景德鎮(zhèn) 333000

約10%的成人惡性腫瘤患者出現(xiàn)有癥狀的腦轉(zhuǎn)移，且該比例仍在上升[1-2]。肺癌是中國目前最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢，而腦部轉(zhuǎn)移是導致肺癌患者治療失敗和死亡的常見原因[3-4]。血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義[5-6]，跨膜蛋白claudin 5、occludin及胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是BBB緊密連接的主要組成部分，其表達水平的降低或缺失可能與腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究采用免疫組織化學法檢測肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織和正常腦組織中claudin 5、occludin及ZO-1的表達情況，旨在探討其與患者臨床特征的關(guān)系[7-8]，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2008年1月至2014年6月景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的術(shù)后存檔石蠟標本為轉(zhuǎn)移組。所有患者均經(jīng)病理組織學檢查確診為肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤，且術(shù)前均未接受化療或放療。63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，腺癌25例，鱗癌14例，小細胞癌22例，腺鱗癌2例；年齡43～71歲，中位年齡57歲。另外，收集同期于本院行顳葉切除術(shù)的28例癲癇患者的術(shù)后正常腦組織石蠟標本為對照組。兩組患者的性別、年齡等資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性，詳見表1。

1.2 主要試劑

兔抗claudin 5（1∶100，ab15106）、occludin（1∶100，ab31721）抗體及羊抗ZO-1（1∶200，ab190085）抗體購自英國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔、鼠抗山羊二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB試劑盒、Envision試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

表1 兩組患者的基本臨床特征[n（%）]

1.3 實驗方法

蠟塊采用連續(xù)切片，厚度3 μm，按照Envision試劑盒說明書的步驟進行免疫組化染色；每種蛋白染色均設立轉(zhuǎn)移組及對照組，以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，以預實驗反復多次證實均呈陽性的肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷

顯微鏡下每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，判定染色強度和陽性細胞百分比。染色強度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞所占百分比：0～19%為0分，20%～39%為1分，40%～59%為2分，≥60%為3分。免疫組化染色結(jié)果由兩位資深病理學專家共同進行評定，以兩項評分之積為最終得分，并定義如下：0～4分為低表達，5～9分為高表達。

1.5 生存隨訪

從術(shù)后病理診斷為肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤之日開始，利用記錄在案的電話，對63例患者進行隨訪，隨訪截至患者死亡、失訪或2015年12月31日，中位隨訪時間為18個月，其中4例患者失訪。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 claudin 5、occludin及ZO-1表達率的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示：claudin 5、occludin、ZO-1陽性表達信號為棕黃色顆粒，均主要定位于腦毛細血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上，另可見少數(shù)星型膠質(zhì)細胞著色，詳見圖1。claudin 5、occludin、ZO-1在正常腦組織中的高表達率分別為50.0%、57.1%、75.0%，均高于肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織的25.4%、34.9%、33.3%，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），詳見表2。

圖1 claudin 5、occludin、ZO-1在不同組織中的表達情況（Envision法，×400）

2.2 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者臨床特征的關(guān)系

claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表達與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的年齡、病灶個數(shù)有關(guān)（P﹤0.05），其中≥60歲、病灶單發(fā)患者腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的高表達率均分別高于﹤60歲、病灶多發(fā)的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。不同性別、腫瘤直徑、病理類型患者腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白的表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。（表3）

2.3 肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5、occludin及ZO-1的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中claudin 5與occludin的表達呈正相關(guān)（r=0.338，P=0.007）；claudin 5與ZO-1的表達呈正相關(guān)（r=0.284，P=0.024）；occludin與ZO-1的表達呈正相關(guān)（r=0.259，P=0.040）。

表2 不同組織中claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達情況的比較[n（%）]

表3 claudin 5、occludin、ZO-1蛋白表達與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者臨床特征的關(guān)系[n（%）]

2.4 claudin 5、occludin、ZO-1低表達組與高表達組肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者的生存情況比較

63例肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，claudin 5低表達與高表達患者的中位總生存期分別為6.3個月和8.2個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.43，P﹤0.01）；occludin低表達與高表達患者的中位總生存期分別為5.0個月和8.2個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.26，P﹤0.01）；ZO-1低表達與高表達患者的中位總生存期分別為6.3個月和7.8個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.70，P﹤0.01）。（圖2～圖4）

3 討論

BBB是由無窗孔的毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的緊密連接（tight junction，TJ）、星形膠質(zhì)細胞足突、細胞基膜和周細胞共同組成的一個復合體[9]，毛細血管內(nèi)皮細胞及其間的TJ是該復合體的主要結(jié)構(gòu)基礎，參與調(diào)節(jié)細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、維持上皮極性、細胞增殖分化、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等重要過程[10]，是血腦間物質(zhì)交換的第一道屏障，也是腫瘤細胞擴散進入腦部的必經(jīng)之路。

圖4 ZO-1高表達組與低表達組的生存曲線圖

Claudin是TJ的主要構(gòu)成成分，通過ZO-1連接于肌動蛋白細胞骨架[11-12]，是決定BBB通透性的關(guān)鍵因素[13]。在腦微血管循環(huán)內(nèi)皮系統(tǒng)中，claudin 5表達豐富，有研究認為claudin 5是構(gòu)成BBB的主要跨膜蛋白[14-15]。occludin是緊密連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是第一個被分離出來的完整的膜蛋白[16]。相關(guān)研究顯示，occludin在腦組織血管內(nèi)皮的表達明顯高于非神經(jīng)組織的血管內(nèi)皮，這也是BBB通透性明顯低于其他血屏障的重要原因[17-18]。ZO-1通過與其同源異構(gòu)體ZO-2、ZO-3形成復合體，為TJ的多種跨膜蛋白及胞質(zhì)蛋白搭建腳手架樣平臺[19]，多數(shù)情況下，只要ZO-1受到破壞，TJ的功能也會隨之發(fā)生變化，因此，ZO-1常被作為評估機體內(nèi)各種組織TJ屏障功能和通透性功能的指標[20-21]。緊密連接結(jié)構(gòu)與功能的變化是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理、生理變化的核心過程。

本研究結(jié)果顯示，claudin 5、occludin、ZO-1在肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤組織中的高表達率均較正常腦組織降低，提示3種蛋白的表達減少可能與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生有關(guān)。研究顯示，claudin 5、occludin、ZO-1在多種腫瘤組織中表達異常，如在胰腺癌的進展中，occludin表達下調(diào)與腫瘤細胞的侵襲性有著密切關(guān)系[22]。Ni等[23]的研究顯示，NSCLC組織中，ZO-1高表達率低于癌旁組織（66.35%vs 83.51%，P﹤0.05），且ZO-1 mRNA的表達水平也低于癌旁組織（0.951±0.556 vs 1.752±1.094，P﹤0.05）。但 Paschoud等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌中能檢測到claudin 5、occludin、ZO-1的表達，而在鱗癌中只能檢測到ZO-1表達，提示不同的緊密連接蛋白可能經(jīng)不同的通路參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。在對胃癌的研究中，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌引起胃癌的一種可能機制是通過激活MLC激酶使MLC磷酸化，破壞claudin 5，進而引起胃上皮細胞的旁滲透增加[25]。另外，occludin、ZO-1表達下降可引起腸道菌群異位，導致胃癌惡病質(zhì)的發(fā)生[26]。Wu等[27]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP1）通過降低 claudin、occludin的表達，使BBB的屏障功能減弱。MMP抑制藥可阻止TJ的退化，減弱BBB的破壞，可作為腦轉(zhuǎn)移瘤治療的一個方向[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)claudin 5、occludin、ZO-1的異常表達與患者的年齡、病灶個數(shù)有關(guān)，其中﹤60歲組患者3種蛋白的高表達率低于≥60歲組患者，病灶個數(shù)越多的患者，claudin 5、occludin、ZO-1的高表達率越低。在食管癌中，claudin 5在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達水平高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組[29]，國內(nèi)學者汪淵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，occludin、ZO-1的異常表達與食管鱗癌的腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著分化程度降低，蛋白表達逐漸減少，且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白陽性表達率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Ohtani等[31]則發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白occludin、ZO-1與胃癌細胞的侵襲性相關(guān)。但在交界性惡性卵巢腫瘤中，有研究發(fā)現(xiàn)，CA125、TATI的表達水平與claudin 5呈正相關(guān)，且腹腔積液的發(fā)生率與claudin 5的表達水平有關(guān)[32]。腦轉(zhuǎn)移瘤好發(fā)于45～60歲人群，男性多于女性，70%～80%屬于多發(fā)。本研究中，3種蛋白在﹤60歲組及多發(fā)者中高表達率低，但在性別方面的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義，由此說明，claudin 5、occludin、ZO-1的表達水平與腦轉(zhuǎn)移瘤的流行病學特點大致相符。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者中，claudin 5、occludin、ZO-1高表達患者的中位生存時間更長，差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。而Nissi等[32]的研究也得出類似的結(jié)果，ZO-1高表達組肺癌患者的5年生存率較低或無表達組患者高（P﹤0.001）。這意味著claudin 5、occludin、ZO-1可能是與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤患者生存期密切相關(guān)的指標，但是否能作為臨床預后的決定性因素，還需要進一步研究。

目前，有關(guān)緊密連接蛋白與各種腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究十分熱門，而緊密連接蛋白與BBB的關(guān)系也很密切，但有關(guān)claudin 5、occludin、ZO-1與肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤關(guān)系的實驗研究卻鮮有報道。綜上所述，腦血管內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白claudin 5、occludin、ZO-1表達減少或缺失，使BBB的結(jié)構(gòu)功能受到破壞，為腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移提供了可能，是肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生的可能機制，但仍有待更深入的研究證實。

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