肝細(xì)胞癌側(cè)群/非側(cè)群細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)差異的檢測(cè)△

呂洋，楊珮珮，葉龍，趙平，姜經(jīng)航

荊門市第二人民醫(yī)院普外科，湖北 荊門 448000

目前腫瘤切除手術(shù)仍然是肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最主要的治療方案之一，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，導(dǎo)致患者的生存率低，預(yù)后差。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此針對(duì)CSC進(jìn)行的靶向治療可能為腫瘤治療的新方向。近年來(lái)，有研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡可影響HCC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后[1]。有報(bào)道指出，miRNA-21可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡，并且與多種腫瘤有關(guān)，miRNA-21表達(dá)上調(diào)的患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間縮短，預(yù)后差[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)MHCC-97H細(xì)胞中側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞和非側(cè)群（nonside population，NSP）細(xì)胞的miRNA-21含量，分析其與CSC的關(guān)系，為進(jìn)一步探討miRNA-21表達(dá)與HCC干細(xì)胞的關(guān)系提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞癌的MHCC-97H細(xì)胞系購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)肝病研究所。Hoechst33342、維拉帕米（verapamil）和7-AAD購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)），高糖DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)），F(xiàn)ACSC Salibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司（美國(guó)），Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），SYBR?Premix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Takara公司（日本），熒光定量PCR儀ABI7300購(gòu)自ABI公司（美國(guó)）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HCC的MHCC-97H細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 SP細(xì)胞檢測(cè)與分選 將處于對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。對(duì)照組：加入Hoechst33342染料前15 min，細(xì)胞懸液中加入verapamil，調(diào)整verapamil濃度為50μmol/L。然后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞懸液中均加入Hoechst33342染料，并且將Hoechst33342染料濃度調(diào)整為5、6、7、8、9、10、11、12 mg/L。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞同時(shí)置于37℃恒溫水浴箱中孵育90 min，為防止細(xì)胞在孵育過(guò)程中出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，每10 min將裝有細(xì)胞的試管混勻1次。90 min后用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌細(xì)胞。將洗滌后細(xì)胞用含有5%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，然后加入7-AAD，調(diào)節(jié)其濃度為1 mg/L。進(jìn)行流式細(xì)胞儀器檢驗(yàn)前需將細(xì)胞過(guò)濾于上樣管中，保存于冰上。具體流程可以參照文獻(xiàn)[3]。重復(fù)3次。

1.2.3 總RNA的提取 選SP、NSP細(xì)胞，離心后收集，Trizol法提取總RNA，總RNA的純度用核酸微量檢測(cè)儀進(jìn)行分析檢測(cè)，總RNA的完整性使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄去除基因組DNA 參照Taraka試劑說(shuō)明書提供的逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）反應(yīng)體系和條件進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。所得cDNA分裝并保存于-20℃冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 RT-PCR 使用Takara公司提供的引物序列，詳見(jiàn)表1。以hsa-U6為內(nèi)參?；虻谋磉_(dá)量通過(guò)2-△△Ct法確定，△△Ct=（CtSP細(xì)胞miRNA-21－CtSP細(xì)胞hsa-U6）－（CtNSP細(xì)胞miRNA-21－CtNSP細(xì)胞hsa-U6）。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP、NSP細(xì)胞的識(shí)別

經(jīng)7-AAD染色后去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）信號(hào)見(jiàn)圖1。通過(guò)Hoechst33342紅光和藍(lán)光雙參數(shù)圖可以區(qū)分SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞，SP細(xì)胞具有外排Hoechst33342染料的作用，因此表現(xiàn)為弱染狀態(tài)，左下角具有2種熒光——預(yù)熱355 nm波長(zhǎng)紫外光，激發(fā)Hoechst33342染料，經(jīng)610 nm雙色短通反射濾鏡分為兩類散射熒光，包括450/30帶通下的藍(lán)光部分（Hoechst blue）以及675/20帶通下的紅光部分（Hoechst red）——均為陰性或很弱的區(qū)域。以Hoechst blue為Y軸，Hoechst red為X軸作二維散點(diǎn)圖，并設(shè)定低Hoechst red及低Hoechst blue且維拉帕米組缺失的區(qū)域?yàn)镾P細(xì)胞的“門”，檢測(cè)并分選SP、NSP細(xì)胞，詳見(jiàn)圖2。

圖1 7-AAD標(biāo)記活細(xì)胞（P0）

圖2 流式細(xì)胞儀分選SP、NSP細(xì)胞

2.2 SP細(xì)胞的監(jiān)測(cè)與分選

采用不同濃度的Hoechst33342對(duì)HCC的MHCC-97H細(xì)胞進(jìn)行染色后，隨著染料濃度的增加，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)減少趨勢(shì)，說(shuō)明染料Hoechst33342可以對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，并且隨著濃度的增加，毒性亦增加。隨之SP細(xì)胞數(shù)量也減少，但是對(duì)照組中仍有SP細(xì)胞存在，細(xì)胞并未完全染色。對(duì)照組SP細(xì)胞數(shù)量為0時(shí)，染色的活細(xì)胞比例較高，對(duì)應(yīng)的染料濃度為10 mg/L，此時(shí)實(shí)驗(yàn)組SP細(xì)胞的平均比例為（8.4±0.7）%。（表2）

2.3 總RNA的純度與完整性

從SP、NSP細(xì)胞中提取的總RNA純度為1.8～2.0，其中沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)混雜。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示3條條帶清晰，并且每種細(xì)胞的總RNA無(wú)拖尾條帶。（圖3）

表2 HCC的MHCC-97H細(xì)胞中活細(xì)胞與SP細(xì)胞的比例（%，±s）

表2 HCC的MHCC-97H細(xì)胞中活細(xì)胞與SP細(xì)胞的比例（%，±s）

Hoechst33342染料濃度（mg/L）5 6 7 8 9 1 0對(duì)照組6.8±1.8 1.9±1.1 0.7±0.3 0.4±0.1 0.2±0.1 11 12活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組98.6±0.9 97.8±1.1 96.4±0.9 94.7±1.3 93.5±0.5 92.4±1.7 88.4±3.4 86.5±2.7對(duì)照組97.7±0.2 96.8±0.4 95.3±1.2 92.6±0.8 90.4±2.2 88.1±2.0 79.1±2.5 76.6±4.3 SP細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組44.8±5.7 32.4±4.2 23.3±4.8 12.0±1.9 10.3±2.1 8.4±0.7 6.3±1.4 3.2±0.9 0 0 0

2.4 SP與NSP細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)情況

以hsa-U6為內(nèi)參，采用RT-PCR法檢測(cè)SP細(xì)胞中miRNA-21的含量是NSP細(xì)胞的（7.30±0.78）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，CSC歸巢是腫瘤轉(zhuǎn)移的本質(zhì)，而干細(xì)胞龕是干細(xì)胞集中存儲(chǔ)的地方，具有特定的微環(huán)境，嚴(yán)格調(diào)節(jié)和控制干細(xì)胞的正?；顒?dòng)[4]。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，CSC從原發(fā)腫瘤病灶脫離，進(jìn)入周圍血管的血液或者淋巴循環(huán)。CSC通過(guò)感受趨化因子的濃度梯度，黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，而后穿過(guò)微血管管壁，在趨化因子的作用下CSC在轉(zhuǎn)移位點(diǎn)尋找干細(xì)胞龕，形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，完成CSC歸巢[5]。因此針對(duì)歸巢的CSC處理的研究有可能為腫瘤的靶向治療提供依據(jù)，可能提高患者的遠(yuǎn)期生存率。但CSC缺乏特異性標(biāo)志物，對(duì)其分離、純化比較困難，因此建立簡(jiǎn)便且有效的分離方法是研究CSC的首要目標(biāo)。

自SP細(xì)胞從小鼠骨髓造血干細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[6]，越來(lái)越多的學(xué)者從多種惡性腫瘤細(xì)胞中分離出具有一定繼續(xù)多向分化、無(wú)限增殖和自我更新的具有干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞[3,7-8]，表明SP細(xì)胞中包含部分CSC。因此，通過(guò)SP細(xì)胞分選方法富集CSC被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便且有效的途徑。

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體可以將針對(duì)細(xì)胞核DNA的Hoechst33342染料排除細(xì)胞外，在流式細(xì)胞系上位于流式標(biāo)記的雙參數(shù)圖左下角，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核不染色或染色程度很低；同時(shí)其外排能力可以被verapamil抑制，SP細(xì)胞比例明顯減少，甚至消失。本研究中對(duì)照組細(xì)胞加入verapamil后，在控制所研究的細(xì)胞具有相對(duì)活性細(xì)胞的前提下，隨著Hoechst33342染料濃度的增加，verapamil阻斷的細(xì)胞中SP標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少，將對(duì)照組SP標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞比例為0時(shí)實(shí)驗(yàn)組存在的且具有活性的細(xì)胞定義為SP細(xì)胞。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀分選出的SP細(xì)胞已經(jīng)被相關(guān)研究證實(shí)具有HCC干細(xì)胞相關(guān)特性[9]。

圖3 總RNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

有研究表明，miRNA在調(diào)控CSC的自我更新和多向分化中發(fā)揮著重要的作用，類似癌基因和抑癌基因的作用[10]。因此推測(cè)將miRNA作為研究CSC的方向，可能為臨床腫瘤治療提供新的治療方案。miRNA-21已經(jīng)證實(shí)與多種惡性腫瘤存在一定的關(guān)系，miRNA-21高表達(dá)可以促進(jìn)肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[2]。有研究表明，在胰腺癌中miRNA-21可以啟動(dòng)CSC，促進(jìn)CSC轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)腫瘤化療抵抗[11]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，多種CSC中miRNA-21表達(dá)上調(diào)，對(duì)CSC的生物學(xué)特性有一定的影響[12]。Misawa等[12]從多種腫瘤細(xì)胞系中分離出具有CSC特性的SP細(xì)胞，基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞的miRNA-21表達(dá)水平高于NSP細(xì)胞，同時(shí)SP細(xì)胞的克隆形成能力受到抑制及對(duì)化療藥物敏感性增強(qiáng)均與miRNA-21表達(dá)下調(diào)有密切的關(guān)系。另外，有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌干細(xì)胞miRNA-21表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)抑制PDCD4表達(dá)增強(qiáng)干細(xì)胞接種于裸鼠后的成瘤能力[13]。同時(shí)，miRNA-21過(guò)表達(dá)可以增加干細(xì)胞的生物學(xué)特性，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步發(fā)展，侵襲、遷移和克隆形成能力明顯增強(qiáng)[14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者Li等[15]通過(guò)分析miRNA基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)大鼠HCC干細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)也出現(xiàn)上調(diào)的情況。本研究中SP細(xì)胞的miRNA-21表達(dá)水平是NSP細(xì)胞的（7.30±0.78）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05），可以間接說(shuō)明miRNA-21表達(dá)與HCC干細(xì)胞存在某種關(guān)系，檢測(cè)患者HCC組織中干細(xì)胞和非干細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)水平，可以評(píng)估患者的腫瘤惡性程度和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)對(duì)于miRNA-21表達(dá)水平高的患者，術(shù)后應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)，采取相應(yīng)的治療方案，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，提高患者的生存率。

綜上所述，本研究采用優(yōu)化Hoechst33342染料濃度的前提下，通過(guò)流式細(xì)胞儀將SP、NSP細(xì)胞從HCC細(xì)胞系MHCC-97H中分離，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的miRNA-21表達(dá)水平高于NSP細(xì)胞，說(shuō)明miRNA-21表達(dá)與HCC干細(xì)胞存在一定的關(guān)系，但其相應(yīng)的分子學(xué)機(jī)制需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Di Leva G，Garofalo M，Croce CM.MicroRNAs in Cancer[J].Annu Rev Pathol,2014,9:287-314.

[2]Pan X,Wang ZX,Wang R.MicroRNA-21 a novel therapeutic target in human cancer[J].Cancer Biol Ther,2010,10(12):1224-1232.

[3]Chiba T,Kita K,Zheng YW,et al.Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties[J].Hepatology,2006,44(1):240-251.

[4]Bissell MJ,Labarge MA.Context,tissue plasticity,and cancer:are tumor stem cells also regulated by the microenvironment?[J].Cancer Cell,2005,7(1):17-23.

[5]Kucia M,Reca R,Miekus K,et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis[J].Stem Cells,2005,23(7):879-894.

[6]Goodell MA,Brose K,Paradis G,et al.Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo[J].J Exp Med,1996,183(4):1797-1806.

[7]Christgen M,Ballmaier M,Bruchhardt H,et al.Identification of a distinct side population of cancer cells in the Cal-51 human breast carcinoma cell line[J].Mol Cell Biochem,2007,306(1-2):201-212.

[8]Wang J,Guo LP,Chen LZ,et al.Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line[J].Cancer Res,2007,67(8):3716-3724.

[9]Guo Z,Jiang JH,Zhang J,et al.Side population in hepatocellular carcinoma HCCLM3 cells is enriched with stemlike cancer cells[J].Oncol Lett,2016,11(5):3145-3151.

[10]Liu C,Tang DG.MicroRNA regulation of cancer stem cells[J].Cancer Res,2011,71(18):5950-5954.

[11]Zhao Y,Zhao L,Ischenko I,et al.Antisense inhibition of microRNA-21 and microRNA-221 in tumor-initiating stem-like cells modulates tumorigenesis,metastasis,and chemotherapy resistance in pancreatic cancer[J].Target Oncol,2015,10(4):535-548.

[12]Misawa A,Katayama R,Koike S,et al.AP-1-Dependent miR-21 expression contributes to chemoresistance in cancerstemcell-likeSPcells[J].OncolRes,2010,19(1):23-33.

[13]Yu Y,Kanwar SS,Patel BB,et al.MicroRNA-21 induces stemness by downregulating transforming growth factor beta receptor 2(TGFbetaR2)in colon cancer cells[J].Carcinogenesis,2012,33(1):68-76.

[14]Han M,Liu M,Wang Y,et al.Re-expression of miR-21 contributes to migration and invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition consistent with cancer stem cell characteristics in MCF-7 cells[J].Mol Cell Biochem,2012,363(1-2):427-436.

[15]Li R,Qian N,Tao K,et al.MicroRNAs involved in neoplastic transformation of liver cancer stem cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29:169.