黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅抗衰老活性的研究

鄭麗娜，趙大慶，趙文學(xué)，劉鈺才，王思明，*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開發(fā)中心，吉林長春130117；2.吉林省北佳中藥集團(tuán)股份公司，吉林長春130117）

黑果腺肋花楸（Aroniamelanocarpa）系薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木，營養(yǎng)含量豐富，因其具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物學(xué)活性而被廣泛關(guān)注[1-2]。已有研究表明，黃酮及酚酸類化合物在黑果腺肋花楸果實(shí)中含量極高，成為其藥理活性作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究的主要成分[3-6]。花青素（Anthocyanin）屬于黃酮類化合物，是一類天然水溶性色素，廣泛分布于植物的果實(shí)中[7-8]。其安全性高，具有多種保健功能，以抗氧化作用最為顯著，被稱為“口服的皮膚化妝品”，可為機(jī)體補(bǔ)充營養(yǎng)并且及時(shí)清除體內(nèi)自由基[9]。然而，截至目前，花青素功能活性研究仍處于起步階段，體內(nèi)研究嚴(yán)重匱乏，限制了其在醫(yī)藥和保健食品中的應(yīng)用。因此，本研究對(duì)黑果腺肋花楸進(jìn)行水提取，并對(duì)其中花青素含量進(jìn)行檢測(cè)，以黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）為體內(nèi)研究對(duì)象，研究黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅壽命、抗氧化相關(guān)指標(biāo)以及氧化損傷下果蠅存活時(shí)間的影響，探討其體內(nèi)抗氧化活性以及對(duì)自由基的清除作用，旨在為黑果腺肋花楸功能性開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑果腺肋花楸：由吉林省北佳中藥集團(tuán)股份公司提供，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室白雪媛副研究員鑒定為薔薇科黑果腺肋屬黑果腺肋花楸；黑果腺肋花楸水提物：由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（P4907）、過氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒（96T）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（100 T/96樣）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（96 T）：南京建成生物工程研究所；百草枯（C10088960）：MACKLIN；30%過氧化氫（1601191）：西隴化工股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ660連續(xù)變倍體式顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；m3x-430智能霉菌培養(yǎng)箱：浙江托普儀器有限公司；UV2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；InfiniteM200PR0全自動(dòng)酶標(biāo)儀：TECAN。

1.3 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用Oregon K野生型黑腹果蠅由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程研究室提供。收集8 h內(nèi)羽化未交配雄性果蠅，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。果蠅壽命實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)溫度（29±1）℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.4 方法

1.4.1 黑果腺肋花楸水提取指標(biāo)性成分花青素含量測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定黑果腺肋花楸水提物中花青素含量。吸取1.00mL黑果腺肋花楸水提物，實(shí)驗(yàn)組1將其用pH=1.0的緩沖液稀釋100倍，實(shí)驗(yàn)組2用pH=4.5的緩沖液稀釋100倍，混勻，放置70min，待反應(yīng)至動(dòng)態(tài)平衡。兩實(shí)驗(yàn)組均以1.00mL 60%酸性乙醇提取液（乙醇含0.2%鹽酸的溶液[10-11]）加入等量緩沖液作空白對(duì)照。用紫外-可見分光光度計(jì)于510nm和710nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)花青素含量計(jì)算公式計(jì)算花青素含量，公式如下：

式中：A為吸光度值；Mt為矢車菊-3-葡萄糖苷相對(duì)分子質(zhì)量449.2；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；e為矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)29 600；b為比色光程長度1 cm；m為試樣質(zhì)量，g。

1.4.2 果蠅培養(yǎng)基的制備

稱取玉米粉175 g，黃豆粉30 g及瓊脂粉20 g，加入3 L純凈水充分?jǐn)嚢枞芙?。保持沸騰狀態(tài)30min后加入60 g安琪酵母粉，50 g蔗糖，50 g葡萄糖，充分混勻后繼續(xù)加熱煮沸。隨后量取90mL甘蔗糖漿加入容器中，冷卻20min，加入10%的尼泊金甲酯40mL及丙酸20mL制成普通培養(yǎng)基。在普通培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別加入不同體積的黑果腺肋花楸水提液，配成1、5、10mg/mL的含藥培養(yǎng)基。

1.4.3 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

將培養(yǎng)于29℃培養(yǎng)箱中的2日齡果蠅隨機(jī)分成4組，對(duì)照組接入普通培養(yǎng)基中，給藥組接入含黑果腺肋花楸水提物培養(yǎng)基中（1、5、10mg/mL）。每組10管，每管20只。每2天記錄果蠅死亡數(shù)，每3天更換1次培養(yǎng)基，直至果蠅全部死亡。每組果蠅全部死亡天數(shù)平均數(shù)為該組平均壽命，每組果蠅半數(shù)死亡天數(shù)為該組半數(shù)死亡時(shí)間，每組最后死亡的20只果蠅存活天數(shù)的平均數(shù)為該組的最高壽命。

1.4.4 急性損傷模型果蠅存活實(shí)驗(yàn)

1.4.4.1 百草枯急性試驗(yàn)對(duì)果蠅存活時(shí)間的影響

果蠅分組情況同1.4.3。培養(yǎng)25 d后，將果蠅轉(zhuǎn)入空培養(yǎng)管中饑餓2 h，隨后將果蠅轉(zhuǎn)入事先放有蘸取1mL 6%的葡萄糖溶液配制成的20mmol/L的百草枯溶液濾紙條的培養(yǎng)管中，每隔4小時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅死亡只數(shù)，直至全部死亡。記錄每組果蠅的平均存活時(shí)間、半數(shù)存活時(shí)間以及最高存活時(shí)間。

1.4.4.2 雙氧水急性試驗(yàn)對(duì)果蠅存活時(shí)間的影響

果蠅分組情況同1.4.3。培養(yǎng)25 d后，將果蠅轉(zhuǎn)入空培養(yǎng)管中饑餓2 h，隨后將果蠅轉(zhuǎn)入事先放有蘸取1mL 6%的葡萄糖溶液配制成的9%H2O2濾紙條的培養(yǎng)管中，每隔4小時(shí)統(tǒng)計(jì)果蠅死亡只數(shù)，直至全部死亡，記錄每組果蠅的平均存活時(shí)間、半數(shù)存活時(shí)間以及最高存活時(shí)間。

1.4.5 果蠅SOD、CAT活性及MDA含量測(cè)定

果蠅分組情況同1.4.3。培養(yǎng)25 d后，先將果蠅轉(zhuǎn)入空培養(yǎng)管中饑餓2 h，麻醉后稱重，按體積比1∶49比例加入生理鹽水，冰浴下勻漿，4℃2 500 r/min離心20min取上清用試劑盒測(cè)定CAT、SOD活性以及MDA含量。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

除黑果花楸中花青素含量測(cè)定數(shù)據(jù)以外，其余數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸水提物指標(biāo)性成分花青素含量測(cè)定

用紫外-可見分光光度計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組溶液在510 nm和710 nm處測(cè)定其OD值，根據(jù)公式計(jì)算黑果腺肋花楸水提物中花青素含量，結(jié)果為（3.4±0.2）mg/g，與目前報(bào)道的其他含有高含量花青素的藍(lán)莓等相比結(jié)果相差無幾[12]，詳見表1。

表1 黑果腺肋花楸水提物中花青素的含量Table1 Contentsof anthocyanin in aqueousextractof Aroniamelanocarpa

2.2 對(duì)果蠅壽命的影響

與對(duì)照組相比，黑果腺肋花楸水提物高劑量組平均壽命延長率為11.24%，最高壽命延長率為3.95%，與對(duì)照組相比均存在顯著差異，詳見表2。

2.3 對(duì)百草枯急性試驗(yàn)果蠅存活時(shí)間的影響

與對(duì)照組相比，黑果腺肋花楸水提物中、高劑量組平均存活時(shí)間約延長了2 h；最高存活時(shí)間分別延長了 0.3、3.0、3.2 h，延長率分別為 1.04%、10.45%、11.14%，其中、高劑量組變化顯著（p＜0.05），見表 3。

表2 黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅壽命的影響（±s，n=200）Table2 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Lifeof Drosophilamelanogaster（±s，n=200）

表2 黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅壽命的影響（±s，n=200）Table2 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Lifeof Drosophilamelanogaster（±s，n=200）

注：* 表示 p＜0.05，顯著；** 表示 p＜0.01，極顯著。

組別劑量/（mg/mL）平均壽命/d半數(shù)死亡時(shí)間/d 最高壽命/d對(duì)照 0 33.8±11.1 35.0 45.6±3.1水提物 1.0 34.8±11.9 38.0 46.5±3.0 5.0 37.0±12.9** 38.0 47.0±3.7 10.0 37.6±11.7** 41.0* 47.4±4.1*

表3 黑果腺肋花楸水提物對(duì)百草枯急性實(shí)驗(yàn)果蠅存活時(shí)間的影響（x±s，n=200）Table3 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa on the Drosophilamelanogaster lifeof paraquatacuteexperimental（x±s，n=200）

2.4 對(duì)過氧化氫急性試驗(yàn)果蠅存活時(shí)間的影響

與對(duì)照組相比，黑果腺肋花楸水提物中、高劑量組平均存活時(shí)間延長了約1 h。最長存活時(shí)間分別延長了3.6、4.8 h，延長率分別10.46%，13.95%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），見表 4。

表4 黑果腺肋花楸水提物對(duì)過氧化氫急性實(shí)驗(yàn)果蠅存活時(shí)間的影響（±s，n=200）Table4 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa onthe Drosophilamelanogaster Lifeofhydrogen peroxideacute experimental（± s，n=200）

表4 黑果腺肋花楸水提物對(duì)過氧化氫急性實(shí)驗(yàn)果蠅存活時(shí)間的影響（±s，n=200）Table4 Effectsofaqueousextract from Aroniamelanocarpa onthe Drosophilamelanogaster Lifeofhydrogen peroxideacute experimental（± s，n=200）

注：* 表示 p＜0.05，顯著。

最高存活時(shí)間/h對(duì)照 0 21.8±6.3 22.0 29.0±3.2水提物 1.0 22.2±6.2 22.0 30.0±2.7 5.0 23.0±6.5* 23.0 31.3±3.1*10.0 23.3±6.4* 23.0 31.6±3.0*組別劑量/（mg/mL）平均存活時(shí)間/h半數(shù)存活時(shí)間/h

2.5 對(duì)相關(guān)果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響

與對(duì)照組相比，黑果腺肋花楸水提物各劑量組均能提高CAT，SOD活性，降低MDA含量（p＜0.05或p＜0.01），且與藥物添加量呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，詳見表5。

表5 黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響（±s，n=3）Table5 Effectsof aqueousextractof Aroniamelanocarpa on antioxidantenzymeactivity and MDA levelof Drosophila melanogaster（±s，n=3）

表5 黑果腺肋花楸水提物對(duì)果蠅抗氧化酶活力及MDA水平的影響（±s，n=3）Table5 Effectsof aqueousextractof Aroniamelanocarpa on antioxidantenzymeactivity and MDA levelof Drosophila melanogaster（±s，n=3）

注：* 表示 p＜0.05，顯著；** 表示 p＜0.01，極顯著。

MDA/（U/mg pro）對(duì)照 0 234.58±18.67 68.54±5.12 1.04±0.37水提物 1.0 265.26±16.23* 71.25±5.75* 0.98±0.41組別 劑量/（mg/mL）SOD/（U/mg pro）CAT/（U/mg pro）5.0 367.12±16.17** 76.56±3.12** 0.93±0.32*10.0 394.34±14.12** 85.41±3.75** 0.64±0.38*

3 討論

壽命是衡量生命衰老規(guī)律的重要指標(biāo)[13]。但大鼠等常用哺乳類模式生物存在生命周期較長、不易于重復(fù)等問題，限制了相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展。近年來，果蠅已經(jīng)成為模擬人類疾病很重要的模式生物，具有生命周期短、繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)簡單等優(yōu)點(diǎn)，遺傳學(xué)分析顯示在哺乳動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中基本的細(xì)胞生物學(xué)信號(hào)通路（signaling transduction pathway）存在驚人的保守性[14]，這些特點(diǎn)使得它們可以成為理想且精良的模式生物?；ㄇ嗨厥窃谒褪卟酥写罅看嬖诘奶烊稽S酮類物質(zhì)，其能保護(hù)人體免受自由基損傷。近年來，花青素對(duì)于抗氧化性、抗衰老性等有較多的研究報(bào)道，其藥理活性功能廣泛，安全性高，應(yīng)用前景大?；ㄇ嗨氐奶崛〖袄砘再|(zhì)研究已取得了很大的進(jìn)步，但其生理功能活性及機(jī)制研究仍處于起步階段。因此，本研究首先對(duì)黑果腺肋花楸提取物中的花青素含量進(jìn)行檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，以黑腹果蠅為研究對(duì)象，以雄性壽命作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究黑果腺肋花楸水提物的抗衰老活性。研究周期短，重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)可信度高。結(jié)果表明：黑果腺肋花楸水提物能顯著延長雄性果蠅的平均壽命和平均最高壽命，且具有一定的劑量效應(yīng)。百草枯在細(xì)胞內(nèi)形成的過量超氧化陰離子自由基和雙氧水產(chǎn)生的羥自由基可誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生氧化損傷。在本研究中，黑果腺肋花楸水提物能夠顯著提高果蠅耐受能力，延長存活時(shí)間，表明黑果腺肋花楸水提物對(duì)于清除超氧陰離子自由基和羥自由基具有一定的作用。SOD和CAT作為體內(nèi)清除活性氧的主要抗氧化酶被認(rèn)為是反應(yīng)體內(nèi)自由基清除能力的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]。而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通常作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[16]。研究結(jié)果表明黑果腺肋花楸水提物能夠提高果蠅體內(nèi)SOD及CAT酶活性，同時(shí)可降低MDA含量，且存在一定的劑量效應(yīng)。綜上所述，黑果腺肋花楸水提物中花青素含量較高，且其抗衰老作用是通過提高體內(nèi)相關(guān)抗氧化酶活性從而增強(qiáng)自由基清除能力而實(shí)現(xiàn)的。

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