楊桃果汁對肝組織抗氧化應激及降糖的研究

楊映霞，黃天敏，黃仁彬，徐小惠

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西南寧530021）

糖尿病是一種慢性糖脂代謝紊亂的疾病，而肝臟作為糖脂代謝的重要器官，兩者關系密不可切。這與肝臟內(nèi)過量的氧化應激導致胰島β細胞功能障礙和胰島素分泌受損有關[1-3]。近年來，2型糖尿病發(fā)病率仍在世界各地大幅增加[4]，其損害肝臟組織的問題也越來越得到重視[5]。

楊桃產(chǎn)自熱帶、亞熱帶，是被子植物門五斂子屬的一種，可治療消化系統(tǒng)疾病、咳嗽和糖尿病等[6-7]，營養(yǎng)價值高且味道酸甜爽口，易被人群接受。多項研究表明楊桃提取物具有降血糖、改善胰島細胞凋亡、改善糖尿病腎病的治療作用以及體外抗氧化的治療作用[8-11]。本研究進一步探討楊桃果汁對糖尿病小鼠肝組織抗氧化應激及其降糖作用的影響，以期完善楊桃藥理功效，為臨床提供合理用藥。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF 級雄性昆明小鼠，體重（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施要求的飼養(yǎng)環(huán)境中。飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，室溫18℃～25℃，相對濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)。實驗動物使用許可證SCXK（桂）2009－0002。

楊桃于2013年6月采自于中國廣西靈山縣，經(jīng)過廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定，制成含生藥濃度為5 kg/L的試液，儲存于陰涼干燥環(huán)境中備用。

鹽酸二甲雙胍片（批號：131019）：北京京豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素（有效期：201512）：美國sigma公司；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號：20140113）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20140210）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號：20140114）、糖原測定試劑盒（批號：20140209）：南京建成生物工程研究所；小鼠琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：201411）、小鼠環(huán)磷酸腺苷酶（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：201411）：北京誠林生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

722型分光光度計：上海精密科學儀器有限責任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、CENTRIFUGE TDL-5型離心機：上海安亭實驗儀器有限公司；FORMA 991超低溫冰箱：Thermo Fornma公司；LDZ4-0.4自動平衡微型離心機：北京離心機廠；HANGPING JA1003型上皿電子天平：上海天平儀器廠。

1.3 糖尿病模型建立及分組給藥

取90只雄性昆明小鼠，造模前禁食12 h，隨機抽取10只作為空白組（即正常對照組），其余小鼠分別靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）0.12 g/kg。72 h后采血測定空腹血糖，凡空腹血糖≥11.1mmol/L視為糖尿病動物模型[12]。將造模成功的小鼠隨機分配成5個組，即模型對照組、二甲雙胍對照組（即陽性對照組 0.32g/kg）、楊桃果汁低、中、高劑量組（5、10、20g/kg），每組10只。每天上午空腹灌胃給藥一次，模型對照組用生理鹽水灌胃，各組連續(xù)灌胃14 d。

1.4 標本的采集

將小鼠取血后處死，立即取其肝臟，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，稱重后放至-80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.5 觀測指標及方法

1.5.1 一般指標及肝糖原測定

觀察小鼠的精神活動、毛發(fā)改變、飲水量、進食量、大小便等一般狀態(tài)，并記錄體重變化情況、死亡情況等。

取肝組織標本，稱重0.5 g，放至室溫，加入30%的氫氧化鉀溶液1.5mL，煮沸20min，放冷，加入3mL無水乙醇，煮沸，放入離心機內(nèi)以轉(zhuǎn)速3 500 r/min.離心10min，傾倒上清液，沉淀用蒸餾水溶解移入25mL容量瓶中定容，制成測試液，按蒽酮法進行測定[13]。

1.5.2 肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化歧化酶（SOD）測定

取肝組織標本，稱重0.5 g，用生理鹽水配成10%肝組織液，用高速勻質(zhì)機制成10%肝組織勻漿，于冷凍離心機3 000 r/min離心15min，取上清液按試劑盒說明書用于肝組織MDA、SOD測定。

1.5.3 肝組織中琥珀酸脫氫酶 （SDH）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的測定

取肝組織標本，按照試劑盒說明書對肝組織SDH、cAMP進行操作和計算。

1.6 胰島形態(tài)學觀察

標本常規(guī)乙醇逐級脫水，石蠟包埋，病理切片，HE染色，光學顯微鏡觀察并采集圖片。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0對所有數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。P＜0.05或 P＜0.01差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠的一般狀況及肝糖原的影響

造模前小鼠精神狀態(tài)好，皮毛光滑，活動自如，飲水量、進食量和大小便正常，造模成功后小鼠精神萎靡，出現(xiàn)多食、多飲和多尿等癥狀，成模小鼠體重略有下降。灌胃給藥后，楊桃果汁中劑量組和高劑量組的小鼠狀態(tài)有較明顯的改善，精神狀態(tài)良好，體重變化與二甲雙胍組差異不大，但相同環(huán)境下的空白組小鼠體重略有增長。各組小鼠中無死亡小鼠。

模型組小鼠的肝糖原含量明顯降低。各組糖尿病小鼠的肝糖原值與正常組比較均有所降低。楊桃果汁中、高劑量組與模型組比較肝糖原含量顯著升高（P＜0.01或 P＜0.05），低劑量組與模型組比較無顯著性差異。

結(jié)果提示楊桃果汁中、高劑量組對小鼠糖尿病癥狀改善有一定作用。各組小鼠體重、肝糖原數(shù)據(jù)見表1。

表1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠體重及肝糖原的影響（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

表1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠體重及肝糖原的影響（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：與模型組相比較△P＜0.05表示顯著，△△P＜0.01表示極顯著。

組別樣本/只初始體重/g 7 d體重/g 15 d體重/g肝糖原含量/（g/kg）空白 10 23.92±1.79 26.95±1.70 28.64±1.81 17.23±1.11模型 10 22.72±1.70 25.84±3.29 25.28±4.20 7.42±1.99二甲雙胍 10 22.98±1.82 26.59±2.09 26.89±3.04 12.73± 1.86△△楊桃果汁低劑量 10 23.02±0.82 25.31±1.76 25.28±2.67 8.39±1.30楊桃果汁中劑量 10 24.80±1.12 26.81±1.95 26.65±2.50 9.21±1.06△楊桃果汁高劑量 10 24.13±1.06 25.79±2.32 26.21±3.45 11.31±1.65△△

2.2 楊桃果汁對糖尿病小鼠肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶（SOD）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的影響

STZ所致糖尿病各組小鼠肝組織較空白組中MDA、cAMP值有顯著增高，SOD值顯著降低，SDH含量有所降低。用藥后，楊桃果汁低、中、高劑量組小鼠較模型組小鼠均能有效降低肝組織MDA值（P＜0.01或0.05），而中、高劑量組小鼠較模型組小鼠能相應增高SOD活力（P＜0.01）。楊桃果汁高劑量組較模型組能升高肝組織中SDH含量（P＜0.05）；能降低小鼠肝組織中cAMP含量（P＜0.05）。用藥后雖提高了機體抗氧化能力，但與正常組比較仍有顯著差異。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠肝組織MDA、SOD、SDH、cAMP的影響（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

表2 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠肝組織MDA、SOD、SDH、cAMP的影響（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：與模型組相比較△P＜0.05表示顯著，△△P＜0.01表示極顯著。

組別樣本數(shù)/只肝組織MDA/（nmol/mgprot）肝組織SOD值/（U/mgprot）SDH含量/（μmol/L）cAMP含量/（nmol/L）空白 10 7.04±0.35 403.25±16.62 210.27±34.29 2.13±0.40模型 10 18.91±1.06 198.83±16.29 158.84±25.08 2.81±0.24二甲雙胍 10 10.74±1.35△△ 350.74±19.49△△ 187.26±24.86△ 2.38±0.52△低劑量 10 17.39±1.79△ 214.85±22.30 163.31±27.34 2.77±0.34中劑量 10 16.18±1.21△△ 257.96±14.51△△ 171.80±24.61 2.65±0.31高劑量 10 12.88±1.87△△ 309.59±13.68△△ 183.17±27.65△ 2.48±0.32△

2.3 各組間小鼠胰島細胞變化比較

肉眼觀察：連續(xù)灌胃14天后取各組小鼠胰腺組織，空白組胰腺組織色淡紅，分葉狀，質(zhì)軟，無充血水腫等癥狀；模型組胰腺蒼白，分葉狀，質(zhì)中，無明顯腫大；給藥各組無明顯差異，胰腺組織色淡紅，分葉狀，質(zhì)軟，無明顯腫大。

顯微鏡下觀察：正常組胰島由大小不等的細胞團構(gòu)成，形態(tài)規(guī)則，與胰腺組織分界線清晰可見，胰島細胞數(shù)量多，體積較大，分布飽滿均勻；模型組胰島細胞形態(tài)不規(guī)則，與胰腺組織分界線模糊，胰島細胞數(shù)量明顯減少，分布稀疏；二甲雙胍組較模型組胰島細胞規(guī)整，與胰腺組織分界線清楚，胰島數(shù)量相對較多；楊桃果汁高、中、低劑量組較模型組胰島細胞形態(tài)規(guī)則，與胰腺組織分界線清楚，其中楊桃中劑量組較之二甲雙胍組胰島形態(tài)無明顯差別。

3 討論

各組間小鼠的體重無明顯差異，與2型糖尿病患者多以肥胖為特點不符[14]，可能由于小鼠患病時間短，且至今未獲得與人類糖尿病完全一致的動物模型有關[15]，又或者與投喂非高脂飼料有關。肝糖原為一種葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存在肝臟，機體內(nèi)通過肝糖原的合成與消耗進行血糖調(diào)節(jié)。當血糖向肝糖原轉(zhuǎn)化，導致血糖降低，肝糖原分解產(chǎn)生葡萄糖，血糖隨之升高[16]。本研究造模組比空白組的肝糖原明顯降低，與糖尿病患者肝糖原較正常人明顯減少的報道相符[17]。

機體內(nèi)氧化物的生成和清除出現(xiàn)失衡的一種狀態(tài)稱為氧化應激，是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的危險因素。作為測量氧化應激常用指標，MDA是脂類氧化的終產(chǎn)物，可加快糖尿病的發(fā)展[18]；SOD可清除氧自由基，減少對細胞的傷害，同時可修復氧自由基造成的細胞損傷[19]，而糖尿病可引起SOD活性降低，持久性高血糖可導致肝臟組織受損[20]。有報道糖尿病患者、糖尿病動物模型抗氧化能力受損，明顯低于正常情況[21-22]，與本研究結(jié)果一致。

SDH是三羧酸循環(huán)的標志性關鍵酶，對糖的有氧氧化起著重要的調(diào)節(jié)作用[23]，通過提高其活性來降低血糖。cAMP是生命信息傳遞的“第二信使”，與胰島β細胞增殖和胰島素分泌密切相關[24]。糖尿病本身可升高cAMP，且高血糖是升cAMP必要的輔助因素[25]，這與造模組較空白組cAMP明顯提高相符。

胰島細胞形態(tài)學結(jié)果表明STZ所致糖尿病小鼠的胰島細胞存在一定損害。而楊桃果汁可以保護胰島細胞，使其形態(tài)相對完整，從而增加胰島素分泌，起到降血糖作用。

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊桃果汁通過推動糖尿病小鼠血糖向肝糖原合成、提高SDH活性以促進三羧酸循環(huán)、保護胰島細胞，增加血糖利用來達到降糖作用。楊桃果汁還能提高肝組織SOD活性、降低MDA含量，通過改善高血糖致氧化應激異常對肝臟的損害，起到保護肝臟的作用。cAMP含量下降對楊桃果汁降糖有一定效果，具體作用機制還需進一步研究。

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