紅河州13種食用花卉的總黃酮、總多酚含量測定

嚴(yán)和平，洪亮，徐進(jìn)諾，羅玉芹，陳雅順，許春，歐朝鳳，張舉成，*

（1.紅河學(xué)院理學(xué)院，云南蒙自661199；2.云南省天然藥物與化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自661199；3.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自661199；4.浙江環(huán)茂自控科技有限公司，浙江杭州310051）

云南擁有中國二分之一的植物資源，是植物資源極為豐富的“天然花園”。云南省東南部的紅河哈尼族彝族自治州居民多有食用花卉的習(xí)慣，劉怡濤[1]在2001年首次全面報(bào)道了云南經(jīng)常食用的花卉種類有303種之多。事實(shí)上，作為植物精華的鮮花除了食用價(jià)值外，還具有觀賞和藥用價(jià)值?；ɑ苤泻械呢S富的黃酮[2-3]、多酚類物質(zhì)[4]氨基酸、微量元素、維生素等物質(zhì)[5]，受到保健食品開發(fā)者的青睞。其中的多酚類和黃酮類化合物在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗腫瘤、調(diào)血脂和降血糖[6-13]等多方面具有良好的效果，從而對(duì)人的身體健康起到一定程度的保護(hù)作用。紅河州食用花卉種類繁多，由于缺乏現(xiàn)代科學(xué)試驗(yàn)分析，得到開發(fā)利用的卻是鳳毛麟角。本文對(duì)云南省紅河州居民經(jīng)常食用的13種花卉中的總黃酮和總多酚含量進(jìn)行了測定，以期為云南省紅河州地區(qū)食用花卉的深度利用和新型天然功能食品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

金雀花（Caragana sinica）、苦刺花（學(xué)名：白刺花，Sophora davidii）、桂花 （學(xué)名：木犀，Osmanthus fragrans）、石榴花（Punica granatum）、芭蕉花（Musa sapientum）、菊花（Chrysanthemummorifolium）、馬桑花（學(xué)名：桑椹，Morus alba）、棠梨花（Pyrus pashia）、黃飯花（學(xué)名：密蒙花，Buddleja officinalis）、玉荷花（學(xué)名：羊蹄甲，Bauhinia purpurea）、雞屎臭藥花（學(xué)名：纈草，Valeriana officinalis）、簾子藤花（學(xué)名：威靈仙，Clematis chinensisOsbeck）、貓屎花（學(xué)名：鼠麴草，Gnaphalium affine）：所用花卉均由菜市場采購。

1.1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）：阿拉丁試劑有限公司；Folin-phenol試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水：浙江娃哈哈飲用水有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OSB-2100恒溫水浴鍋：上海安亭科學(xué)儀器廠；AR1140電子分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；DY-300粉碎機(jī)：南陽東億機(jī)械設(shè)備有限公司；Brand移液槍：德國Brand公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

13種花卉分別在60℃烘干至恒重，經(jīng)粉碎過200目篩，低溫、避光、密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｆ叫芯芊Q取3份1.000 g研磨好的各種花的粉末于150mL圓底燒瓶中，加入 80%的乙醇溶液，料液比 1∶20（g/mL），80℃恒溫水浴浸提160min，過濾，濾液用60%的乙醇溶液定容至50mL，待測。

1.3.2 含量測定

1.3.2.1 總黃酮含量測定

總黃酮含量采用雙波長分光光度法進(jìn)行測定[14-15]。準(zhǔn)確量取一定量樣液于10mL比色管中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液和10%硝酸鋁溶液各0.2mL，搖勻，放置6min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液2.0mL，加水定容至5mL，絡(luò)合反應(yīng)15min，在510 nm和584 nm條件下測定。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)?？傸S酮提取率（以蘆丁計(jì)，%）的計(jì)算公式為（1）式。

式中：C為測試樣品液的黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；V

式中：C為測試樣品液的多酚濃度，μg/mL；V為提取液總體積，mL；K為提取液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.3.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用60%乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中，制成100μg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密吸取 0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60mL 的儲(chǔ)備液于比色管中，加60%乙醇至10 mL，按照“1.3.2.1”的方法，測定波長510、584 nm條件下的吸光度值，得到吸光度差值△A=A510nm-A584nm，以蘆丁濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度差值△A（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=16.149x+0.000 5（R2=0.999 2），表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在 0～32 μg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度差值呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取干燥的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg，蒸餾水溶解并定容至10mL，制成250μg/mL的儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確移取1.00mL儲(chǔ)備液定容至10mL，制成25μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取25μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL，按照“1.3.2.2”的方法，測定波長765nm條件下的吸光度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，吸光度為Y軸，建立沒食子酸吸光度（Y）與標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X）之間的線性回歸方程：y=128.48x+0.029 26（R2=0.998 2），表明沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～10μg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。為提取液總體積，mL；K為提取液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量；g。

1.3.2.2 總多酚含量測定

依據(jù)GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中多酚的測定方法，在765 nm處有最大吸收波長，利用紫外分光光度法測定食用花卉提取液中總多酚含量?？偠喾雍浚ㄒ詻]食子酸計(jì)，%）的計(jì)算公式為（2）式。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 黃酮測定條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1.1 5%亞硝酸鈉溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響

分別取 5%亞硝酸鈉溶液 0.1、0.2、0.3、0.4mL 加入到體系中，按上述“1.3.2.1”的方法進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 5%亞硝酸鈉溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響Fig.1 Effectof the volum eof 5%NaNO2 solution on the flavones content

圖1 表明：當(dāng)5%亞硝酸鈉溶液的體積在0.1mL～0.4mL之間時(shí)，測量體系的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.915%，即5%亞硝酸鈉溶液的體積在0.1mL～0.4mL之間時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]，選擇測定時(shí)5%亞硝酸鈉溶液用量為0.2mL。

2.1.1.2 10%硝酸鋁溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響

分別取 0.1、0.2、0.3、0.4mL 10%硝酸鋁溶液加入體系中，按上述“1.3.2.1”項(xiàng)的方法進(jìn)行測量，結(jié)果見圖2。

圖2 10%硝酸鋁溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響Fig.2 Effectof the volum eof 10%A l（NO3）3 solution on the flavones content

圖2 表明：體系中10%硝酸鋁溶液體積的加入量從0.1mL增加至0.2mL時(shí)，黃酮檢出量也逐漸增加；體積從0.2mL增加至0.4mL時(shí)，對(duì)黃酮的檢測影響不大，體系的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.943%，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]，選擇測定時(shí)10%硝酸鋁溶液用量為0.2mL。

2.1.1.3 4%氫氧化鈉溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響

分別取1.0、1.5、2.0、2.5mL 4%氫氧化鈉溶液加入體系中，按上述“1.3.2.1”項(xiàng)的方法進(jìn)行測量，結(jié)果見圖3。

圖3表明：體系中4%氫氧化鈉溶液體積的加入量從1.0mL增加至1.5mL時(shí)，黃酮檢出量也逐漸增加；體積從1.5mL增加至2.5mL時(shí)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，體系的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.469%，結(jié)合參考文獻(xiàn)[14]，選擇測定時(shí)4%氫氧化鈉溶液用量為2.0mL。

圖3 4%氫氧化鈉溶液的體積對(duì)黃酮含量的影響Fig.3 Effectof thevolumeof4%NaOH solution on the flavones content

2.1.2 多酚測定條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.2.1 15%碳酸鈉溶液的體積對(duì)多酚含量的影響

按“1.3.2.2”的方法，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4mL，顯色劑 Folin-phenol為 0.2mL，分別加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0、1.2mL 15%碳酸鈉溶液，避光反應(yīng) 1.5 h，在765 nm測定吸光度，結(jié)果見圖4。

圖4 15%碳酸鈉溶液的體積對(duì)多酚含量的影響Fig.4 Effectof the volum eof 15%Na2CO3 solution on the polyphenols content

由圖4可知：15%碳酸鈉溶液用量從0.1mL增加至0.4mL時(shí)，沒食子酸的檢出量逐漸增加，15%碳酸鈉溶液用量為0.4mL時(shí)濃度值最高，之后，15%碳酸鈉溶液用量從0.4mL增加至1.2mL時(shí)，沒食子酸的檢出量都比0.4mL用量時(shí)小，因此本試驗(yàn)15%碳酸鈉溶液用量選用0.4mL。

2.1.2.2 Folin-phenol試劑的體積對(duì)多酚含量的影響

按“1.3.2.2”的方法，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4mL，15%碳酸鈉用量 0.8mL，分別加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mLFolin-phenol試劑，避光反應(yīng) 1.5 h，在765 nm測定吸光度，結(jié)果見圖5。

圖5 Folin-phenol試劑的體積對(duì)多酚含量的影響Fig.5 Effectof thevolumeof Folin-phenolagenton the polyphenolscontent

由圖5可知：Folin-phenol試劑用量從0.1mL增加至0.4mL時(shí)，沒食子酸的檢出量增大，F(xiàn)olin-phenol試劑用量為0.4mL時(shí)達(dá)到最高，之后，F(xiàn)olin-phenol試劑用量從0.4mL增加至0.7mL時(shí)，沒食子酸檢出量逐漸減小，因此本實(shí)驗(yàn)Folin-phenol試劑用量選用0.4mL。

以后的樣品均在0.4mL 15%碳酸鈉溶液、0.4mL Folin-phenol試劑的條件下進(jìn)行測定。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.1 總黃酮測定的穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3.2.1”的方法配制好待測體系后，在 5、10、15、20、25、30、35、40、45、60、90、120、150、180min 時(shí)測定，結(jié)果見圖6。

圖6 總黃酮的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The resultsof stability experim entof total flavonoids

從圖6得出，隨反應(yīng)時(shí)間從5min增加到180min，體系在510 nm和584 nm處的吸光度差值逐漸下降，提示黃酮檢出量在下降，15min后測定結(jié)果的RSD值大于5%，說明總黃酮反應(yīng)體系在15min內(nèi)穩(wěn)定，以后樣品均在反應(yīng)15min的條件下進(jìn)行測定。

2.2.2 總多酚測定的穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“1.3.2.2”的方法配制好待測體系后，在10、20、30、40、50、60、90、120、150min 時(shí)測定，60min 內(nèi)間隔10min測定一次，60min后間隔30min測定一次，結(jié)果如圖7。

圖7 總多酚的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 The resultsof stability experimentof totalpolyphenols

從圖7得出，在0到60min以內(nèi)，該反應(yīng)體系的多酚檢出量一直上升，在90min后基本保持不變，在150min內(nèi)測定結(jié)果的RSD為2.67%，表明該方法在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，以后樣品均在反應(yīng)1.5 h的條件下進(jìn)行測定。

2.3 方法精密度試驗(yàn)

分別取一定量的蘆丁和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果，各平行試驗(yàn)5次，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table1 The precision experimental results

黃酮和多酚檢測結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.76%和4.27%，表明該檢測方法的精密度良好。

2.4 樣品含量測定

2.4.1 食用花卉中總黃酮含量測定

每種花卉粉末樣品稱取1.000 g，平行3次，并按“1.3.1”的方法制備樣品液，取一定體積的樣液按“1.3.2.1”的方法測定，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 13種食用花卉的總黃酮和總多酚含量Table2 Total flavonesand totalpolyphenolscontents in 13 types edible flowers

續(xù)表2 13種食用花卉的總黃酮和總多酚含量Continue table2 Total flavonesand totalpolyphenols contents in 13 typesedible flowers

由表2可知：13種食用花卉總黃酮含量順序是：桂花＞黃飯花＞棠梨花＞貓屎花＞玉荷花＞雞屎臭藥花＞簾子藤花＞芭蕉花＞石榴花＞馬?；ǎ揪栈ǎ窘鹑富ǎ究啻袒ā?3種食用花卉的總黃酮含量差別較大，含量最高的是桂花，為23.93%；含量最低的是苦刺花，為0.22%，兩者總黃酮含量相差一百倍之多。

經(jīng)大量文獻(xiàn)檢索表明，紅河州13種食用花卉中，苦刺花、馬?；?、棠梨花、雞屎臭藥花、貓屎花的總黃酮含量鮮見報(bào)道。在文獻(xiàn)[16]中，桂花的總黃酮含量為（233.01±7.42）mg/g，與本次試驗(yàn)值相當(dāng)。文獻(xiàn)[17-22]中金雀花、石榴花、芭蕉花、黃飯花、玉荷花、簾子藤花的總黃酮含量與本文測定值比均偏高，可能的原因是文獻(xiàn)中采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法設(shè)計(jì)獲得針對(duì)該種花的最佳提取工藝。進(jìn)行提取時(shí)，能使其黃酮類化合物得到充分、有效的提取。建議以后對(duì)食用花卉開發(fā)利用時(shí)，在最佳提取工藝條件下進(jìn)行。

2.4.2 食用花卉中總多酚含量測定

每種花卉粉末樣品稱取1.000 g，平行3次，并按“1.3.1”的方法制備樣品液，取一定體積的樣液按“1.3.2.2”所述方法測定，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。結(jié)果見表2。由表2可知：13種食用花卉總多酚含量順序是：石榴花＞桂花＞棠梨花＞貓屎花＞黃飯花＞雞屎臭藥花＞玉荷花＞簾子藤花＞芭蕉花＞菊花＞金雀花＞馬?；ǎ究啻袒āＴ诳疾斓?3種食用花卉中，除桂花和黃飯花外，其余花卉總多酚含量均高于總黃酮含量?？偠喾雍恳悦勺缘氖窕ㄗ罡?，為13.16%，苦刺花最低僅為0.83%。

經(jīng)大量文獻(xiàn)檢索表明，紅河州13種食用花卉中，金雀花、苦刺花、芭蕉花、馬?；ā⑻睦婊?、黃飯花、玉荷花、雞屎臭藥花、簾子藤花、貓屎花的總多酚含量鮮見報(bào)道。在文獻(xiàn)[16]中，桂花的總多酚含量為（90.60±6.88）mg/g，與本次實(shí)驗(yàn)值相當(dāng)。石榴花中多酚的研究報(bào)道不多，很多研究者都把目光集中在石榴皮和石榴籽中多酚研究上。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別各取3份已知黃酮和多酚含量的金雀花樣品，準(zhǔn)確加入1.00mg蘆丁或沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照“1.3.2.1”和“1.3.2.2”進(jìn)行試驗(yàn)，分別計(jì)算得到黃酮和多酚的回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table3 The recovery experim ental results（n=3）

黃酮的平均回收率為98.8%，多酚的平均回收率為97.5%；黃酮和多酚回收率3次測定的RSD值分別為1.08%和2.86%，小于3%，表明回收率結(jié)果良好。

3 結(jié)論

對(duì)紅河州13種食用花卉中的總黃酮和總多酚進(jìn)行了提取和測定，并對(duì)各種花中的總黃酮和總多酚含量進(jìn)行了比較，結(jié)果表明總黃酮含量順序是：桂花＞黃飯花＞棠梨花＞貓屎花＞玉荷花＞雞屎臭藥花＞簾子藤花＞芭蕉花＞石榴花＞馬?；ǎ揪栈ǎ窘鹑富ǎ究啻袒??？偠喾雍宽樞蚴牵菏窕ǎ竟鸹ǎ咎睦婊ǎ矩埵夯ǎ军S飯花＞雞屎臭藥花＞玉荷花＞簾子藤花＞芭蕉花＞菊花＞金雀花＞馬?；ǎ究啻袒?。桂花的黃酮含量高于其他測試花卉，并且其多酚含量也僅次于石榴花位居第二；石榴花的多酚含量最高。無論是總黃酮和總多酚的含量均是苦刺花最低。

13種紅河州食用花卉中馬?；ā⑻睦婊?、雞屎臭藥花、貓屎花的總黃酮含量鮮見報(bào)道；金雀花、苦刺花、芭蕉花、馬桑花、棠梨花、黃飯花、玉荷花、雞屎臭藥花、簾子藤花、貓屎花的總多酚含量鮮見報(bào)道。對(duì)紅河州經(jīng)常食用的13種花卉中的總黃酮和總多酚含量的測定，為這些食用花卉的深度開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

13種紅河州食用花卉中石榴花中的多酚含量最高，并且紅河州有大面積種植的石榴資源，可以為進(jìn)一步開發(fā)石榴花提供原料支持，同時(shí)能為當(dāng)?shù)胤N植業(yè)創(chuàng)收。棠梨花中黃酮和多酚含量均較高，可以進(jìn)一步研究開發(fā)為功能型保健食品，從而提高附加值。

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