富硒蛹蟲草中有機(jī)硒的分析

陳尚龍，劉輝，張建萍，*，戴意強(qiáng)，魏云

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221018；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221018）

Se是1種對人體健康有著重大意義的必需微量營養(yǎng)元素，它可以與人體內(nèi)一些酶結(jié)合形成具有很強(qiáng)抗氧化能力的物質(zhì)，從而增強(qiáng)人體的免疫力[1]。Se需要通過食物從外界攝入，平時食用的食物中Se含量極低，很難滿足人體正常需要，導(dǎo)致缺Se現(xiàn)象較為普遍，嚴(yán)重威脅人體健康[2-3]。如何科學(xué)地補(bǔ)Se已成為研究熱點(diǎn)。近年來，隨著對富硒產(chǎn)品功能研究的深入，已經(jīng)認(rèn)識到高品質(zhì)富硒產(chǎn)品不僅取決于硒的含量，還與硒的形態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)[4-8]。在人體內(nèi)不同形態(tài)的Se有著不同的化學(xué)行為和生物活性[9-10]。相關(guān)研究報告表明，無機(jī)硒不易被人體吸收，生物活性低，具有一定毒性，攝入不當(dāng)會引起慢性中毒；而經(jīng)過生物轉(zhuǎn)換的有機(jī)硒，易被人體吸收，毒性低，具有的生物學(xué)功能是由硒蛋白來調(diào)控和實(shí)現(xiàn)的[11-14]，因此與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒更為重要。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室研制的富硒蛹蟲草為研究對象。首先，參照DBS42/002-2014《湖北省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)富有機(jī)硒食品硒含量要求》制備出富硒蛹蟲草總硒測定試樣；其次，參照GB 1903.21-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑富硒酵母》制備出富硒蛹蟲草無機(jī)硒測定試樣；然后，再使用高分辨-連續(xù)光源石墨爐原子吸收光譜法（high resolution-continuum source graphite furnace atomic absorption spectrophotometry，HR-CSGFAAS）[15-23]進(jìn)行測定；最后，根據(jù)“有機(jī)硒含量（mg/g）=總硒含量（mg/g）-無機(jī)硒含量（mg/g）”計算出富硒蛹蟲草中有機(jī)硒含量，為快速、準(zhǔn)確檢測食品中微量元素含量及其形態(tài)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒蛹蟲草：江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的樣品。

濃硝酸、高氯酸、φ（乙醇）=95%、Mg（NO3）2、Pd（NO3）2（均為優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Se標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）：國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心；18.2MΩ·cm超純水；氬氣（純度大于99.99%）；玻璃器皿均用φ（HNO3）=5%溶液浸泡24 h以上。

1.2 儀器與設(shè)備

ContrAA 700高分辨連續(xù)光源原子吸收光譜儀（配有MPE60自動進(jìn)樣器）：德國Analytik Jena公司；L550離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)：美國Pall公司；FA-2004B電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；220V-AC電子電爐（0～2 000W）：上海樹立儀器儀表有限公司；移液器：德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作參數(shù)

HR-CSGFAAS測定Se工作參數(shù)：分析譜線為196.026 7 nm，載氣為高純氬氣，基體改進(jìn)劑為Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液，基體改進(jìn)劑添加體積為5μL，進(jìn)樣體積為20μL，灰化溫度為1 100℃，原子化溫度為2 200℃，原子化升溫速度為1 500℃/s。

1.3.2 基體改進(jìn)劑溶液的配制

用 φ（HNO3）=0.5%溶液溶解 0.1 g Pd（NO3）2和0.05 g Mg（NO3）2后轉(zhuǎn)移至 100mL 容量瓶中，再用此溶液定容至刻度，配制成1 g/L Pd（NO3）2和0.5 g/L Mg（NO3）2混合溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

用移液槍準(zhǔn)確移取60μLSe標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）置于100mL容量瓶中，再用φ（HNO3）=0.5%溶液定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.6mg/L的Se標(biāo)準(zhǔn)使用液，再通過MPE自動進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度梯度為 0.03、0.09、0.15、0.30、0.45、0.60mg/L。

1.3.4 樣品前處理

總硒測定試樣制備（參照DBS42/002-2014）：準(zhǔn)確稱取0.5 g～2.0 g（精確至0.1mg）富硒蛹蟲草粉末試樣，置于150mL高筒燒杯內(nèi)，加10.0mL混合酸（硝酸與高氯酸按體積比4∶1混合）及幾粒玻璃珠，蓋上表面皿冷消化過夜。次日于電熱板上加熱，并及時補(bǔ)加混合酸。當(dāng)溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙時，再繼續(xù)加熱至剩余體積2mL左右，切不可蒸干。冷卻，再加5mL鹽酸（6mol/L），繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，以完全將六價硒還原成四價硒。冷卻，轉(zhuǎn)移定容至50mL容量瓶中，同時做空白試驗(yàn)。

無機(jī)硒測定試樣制備參照GB 1903.21-2016：準(zhǔn)確稱取1 g左右（精確至0.1mg）富硒蛹蟲草粉末試樣，置于50mL小燒杯中，加入25mLφ（乙醇）=95%，在磁力攪拌器中攪拌30min，使試樣充分溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用φ（乙醇）=95%定容至刻度，振蕩、搖勻，靜置于冰箱1 h。將定容后的溶液置于4 000 r/min條件下離心30min。同時做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基體改進(jìn)劑添加體積的優(yōu)化

試驗(yàn)以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進(jìn)劑，基體改進(jìn)劑的添加體積是影響Se吸光度的因素之一，為了最大限度地消除基體干擾，提高Se的吸光度。試驗(yàn)在固定其他參數(shù)條件下，只改變基體改進(jìn)劑的添加體積，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 基體改進(jìn)劑的體積對吸光度的影響Fig.1 Effectofm atrixm odifier volum eon absorbancy

由圖 1 可知，以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進(jìn)劑能顯著地提高Se的吸光度，這是由于不添加基體改進(jìn)劑時，過高的灰化溫度會導(dǎo)致Se揮發(fā)損失，使Se的吸光度降低。當(dāng)添加體積＜5μL時，Se的吸光度隨著基體改進(jìn)劑添加體積的增大而增大；當(dāng)體積≥5μL時，增加趨勢趨于平緩。因此，試驗(yàn)選擇基體改進(jìn)劑最佳添加體積為5μL。

2.2 灰化溫度的優(yōu)化

灰化溫度是影響Se吸光度的因素之一，過低的灰化溫度無法使基體完全灰化，導(dǎo)致背景吸光度升高；過高的灰化溫度會導(dǎo)致Se揮發(fā)損失，使Se的吸光度降低，重復(fù)性變差。試驗(yàn)在固定其他參數(shù)條件下，只改變灰化溫度，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)灰化溫度＜1 100℃時，Se的吸光度隨著灰化溫度的增大而增大；當(dāng)灰化溫度≥1 100℃時，Se的吸光度開始下降。因此，試驗(yàn)選擇最佳的灰化溫度為1 100℃。

2.3 原子化溫度的優(yōu)化

原子化溫度也是影響Se吸光度的因素之一，過低的原子化溫度無法使Se徹底原子化，導(dǎo)致其吸光度降低，吸附峰峰形變差；過高的原子化溫度會減少石墨管的使用次數(shù)。試驗(yàn)在固定其他參數(shù)條件下，只改變原子化溫度，測定Se的吸光度，結(jié)果如圖3所示。不同原子化溫度條件下，Se的吸收峰峰形如圖4所示。

圖2 灰化溫度對吸光度的影響Fig.2 Effectof ashing temperatureon absorbancy

由圖3可知，當(dāng)原子化溫度＜2 200℃時，Se的吸光度隨著原子化溫度的增大而增大；當(dāng)原子化溫度≥2 200℃時，Se的吸光度趨于穩(wěn)定。由圖4可知，當(dāng)原子化溫度為2 000℃和2 100℃時，Se的吸收峰峰形較差，拖尾現(xiàn)象明顯；當(dāng)原子化溫度為2 200℃和2 300℃時，Se的吸收峰峰形較好，無明顯拖尾現(xiàn)象。因此，試驗(yàn)選擇最佳的原子化溫度為2 200℃。

圖3 原子化溫度對吸光度的影響Fig.3 Effectof atom izing temperatureon absorbancy

圖4 原子化溫度對Se吸收峰的影響Fig.4 Effectof atom izing tem peratureon selenium absorption peak

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

通過ASpect CS軟件設(shè)置Se的檢測方法，將0.60mg/LSe 標(biāo)準(zhǔn)使用液、Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液、稀釋適當(dāng)倍數(shù)的空白溶液和待測樣品溶液放入MPE自動進(jìn)樣器的對應(yīng)位置，建立相應(yīng)的測定序列，使用HR-CSGFAAS進(jìn)行順序測定。以Se的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、Se的吸光度為縱坐標(biāo)，經(jīng)AS-pectCS軟件繪制非線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖5所示。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.5 Standard working curves

所得方程為A=（0.037 312 5+0.917 625 5c）/（1+0.304 683 9c），相關(guān)系數(shù)為 0.999 2，表明在 0～0.6mg/L范圍內(nèi)，Se的質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的關(guān)系。

2.5 富硒蛹蟲草中有機(jī)硒的測定

在最佳試驗(yàn)條件下測定總硒和無機(jī)硒的含量，根據(jù)“有機(jī)硒含量（mg/g）=總硒含量（mg/g）-無機(jī)硒含量（mg/g）”計算出富硒蛹蟲草中有機(jī)硒的含量，結(jié)果見表1。

表1 富硒蛹蟲草中有機(jī)硒的含量（n=3）Tab le1 The contentsof organic Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表1可知，富硒蛹蟲草總硒含量為1.407mg/g，無機(jī)硒含量為0.083mg/g，計算出有機(jī)硒含量為1.324mg/g，所占百分比為94.1%，這說明富硒蛹蟲草含有豐富的有機(jī)硒，是補(bǔ)硒良品。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

將一定體積Se標(biāo)準(zhǔn)溶液和富硒蛹蟲草一起加入到燒杯或錐形瓶中，按1.3.4節(jié)進(jìn)行操作，在最佳試驗(yàn)條件下進(jìn)行測定，計算Se的加標(biāo)回收率[24-25]，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率（n=3）Table2 Recoveriesof Se in selenium-enriched Cordycepsm ilitaris（n=3）

由表2可知，總硒和無機(jī)硒的加標(biāo)回收率分別為95.7%和94.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4.5%，表明參照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016測定富硒蛹蟲草總硒和無機(jī)硒，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，添加的Se標(biāo)準(zhǔn)溶液（無機(jī)硒）幾乎全部在待測無機(jī)硒試樣中。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以 Pd（NO3）2（1 g/L）和 Mg（NO3）2（0.5 g/L）混合溶液為基體改進(jìn)劑，通過試驗(yàn)優(yōu)化出基體改進(jìn)劑最佳添加體積為5μL，最佳灰化溫度為1 100℃，最佳原子化溫度為2 200℃。測定結(jié)果表明，富硒蛹蟲草總硒含量為1.407mg/g，無機(jī)硒含量為0.083mg/g，計算出有機(jī)硒含量為1.324mg/g，所占百分比為94.1%，這說明富硒蛹蟲草含有豐富的有機(jī)硒，是補(bǔ)硒良品?？偽蜔o機(jī)硒的加標(biāo)回收率分別為95.7%和94.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜4.5%，表明參照DBS42/002-2014和GB 1903.21-2016測定富硒蛹蟲草總硒和無機(jī)硒，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，添加的Se標(biāo)準(zhǔn)溶液（無機(jī)硒）幾乎全部在待測無機(jī)硒試樣中。

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