正交試驗(yàn)優(yōu)選馬齒莧黃酮脫色工藝的研究

馬驍，王飛飛，袁永雷，曲麗萍

（昆明貝泰妮生物科技有限公司，上海201702）

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧（Portulaca oleracea L.）的全草，又稱為“五行草”、“長命草”，在世界上的熱帶和亞熱帶地區(qū)都有較廣泛的分布，我國除了高寒地區(qū)外，各地都有分布[1]。《本草經(jīng)集注》記載馬齒莧有清熱解毒，散血消腫的效用，同時它也是我國衛(wèi)生部劃定的101種藥食同源的野生植物之一，因此在國內(nèi)外有著廣泛的使用，是一種極具開發(fā)價(jià)值的綠色食品[2]。

馬齒莧富含多酚類、黃酮類、生物堿類等化合物[3]，其中的黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化活性，可以降低血脂、降低血黏度、抑制動脈粥樣硬化[4]，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用[2，5-6]，因此，國內(nèi)外學(xué)者對馬齒莧黃酮的提取工藝做了大量的研究[7-9]。不同產(chǎn)地的馬齒莧黃酮成分含量差異明顯，文獻(xiàn)報(bào)道其含量在2%～12%之間[2，9-10]，然而該總黃酮顏色多為棕褐色，影響成品質(zhì)量，限制了其在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用，有必要進(jìn)行脫色處理?；钚蕴孔鳛橐环N常用脫色劑，具有污染小，吸附量大的特點(diǎn)[11]。因此，本文先通過大孔樹脂富集馬齒莧總黃酮部位，然后選用活性炭作為吸附劑，分別以脫色時間、脫色溫度、活性炭用量為變量，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選適合馬齒莧總黃酮的脫色工藝，并用建立的脫色工藝對3個產(chǎn)地的馬齒莧進(jìn)行提取脫色，比較脫色率和黃酮保留率的差異，為馬齒莧總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI；EA-2004分析天平：上海?？惦娮觾x器；85-2磁力加熱攪拌器：上海司樂儀器；Cary-60紫外-可見分光光度儀：美國Agilent；布氏漏斗：中國唐明陶瓷。

1.2 材料

馬齒莧：產(chǎn)地分別為云南昆明、廣西玉林、河南鄭州、安徽亳州，經(jīng)昆明植物研究所劉海洋研究員鑒定為馬齒莧屬植物馬齒莧（Portulaca oleracea L.）；AB-8大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料公司；蘆?。兌?8.7%，批號Q2700050）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁及氫氧化鈉均：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬齒莧總黃酮的提取與精制

稱取來自云南省昆明市的馬齒莧200 g用1.6 L 60%乙醇回流提取兩次，每次提取2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏53.70 g，取浸膏10.24 g用AB-8大孔樹脂進(jìn)行總黃酮富集，先用水洗5個樹脂柱體積（bed volume，BV）去掉非目標(biāo)成分，然后40%乙醇洗脫8 BV，合并40%乙醇洗脫液，減壓濃縮得馬齒莧總黃酮1.80 g，得率為17.58%。

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參照文獻(xiàn)[12]，用硝酸鋁比色法對蘆丁在500 nm下進(jìn)行測定，得蘆丁溶液在各濃度時的吸光度。以蘆丁溶液濃度（y）對吸光度（x）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.744 8x-0.005，R2=0.999 3。

2.2.2 樣品測定

分別精密稱取馬齒莧提取物100mg 3份，馬齒莧總黃酮100mg3份，分別用20%乙醇水溶解于50mL容量瓶，作為供試品溶液。根據(jù)回歸方程求出各供試品的總黃酮濃度，求出平均值，得到馬齒莧提取物中總黃酮的含量為3.30%，馬齒莧經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后總黃酮含量為7.13%。

2.3 單因素考察

選取脫色溫度，脫色時間，活性炭用量作為考察因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察3個因素對脫色效果的影響。具體操作為取馬齒莧總黃酮60mg，精密稱定，用20%乙醇水溶液定容至15mL容量瓶中，溶液呈棕褐色，將其轉(zhuǎn)移至25mL燒杯中進(jìn)行脫色考察。按設(shè)計(jì)要求，加入適量的活性炭，并稱取總量，在設(shè)定的溫度中加熱攪拌一定時間，用20%乙醇水溶液補(bǔ)齊重量，之后趁熱過濾除去活性炭，收集濾液，各取1mL，用硝酸鋁比色法對其在500 nm下測定吸光度，該吸光度與總黃酮含量成正比，吸光度越大總黃酮含量越高[12]。

2.3.1 黃酮保留率和脫色率的計(jì)算

用黃酮保留率和脫色率來評價(jià)活性炭的脫色效果，根據(jù)參考文獻(xiàn)選取420 nm處的吸光度作為評價(jià)脫色效果的指標(biāo)[13-14]，并按下面的公式對黃酮保留率和脫色率進(jìn)行計(jì)算：

黃酮保留率=脫色后總黃酮含量/脫色前總黃酮含量×100%

脫色率=（脫色前吸光度-脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%

2.3.2 溫度對脫色效果的影響

按 1%的活性炭加入量，設(shè)置 30、40、50、60、70 ℃5個脫色溫度，用磁力攪拌器攪拌20min。過濾，比較各濾液顏色，結(jié)果顯示顏色由深至淺依次為30℃棕色，40℃淺棕色，50℃淺棕色，60℃淺黃略棕色，70℃淺黃色。離心取上清，測定吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 不同脫色溫度下的脫色效果Fig.1 Effectsof temperatureon decolorization

由圖1可知，隨著溫度升高，脫色率上升，當(dāng)溫度升高至50℃時黃酮保留率最高，在之后有緩慢下降趨勢，因此50℃左右是其較佳脫色溫度。

2.3.3 時間對脫色效果的影響

按1%的活性炭加入量，設(shè)置溫度為50℃，脫色時間分別為 10、20、40、50、60min，磁力攪拌器攪拌到各時間后，趁熱過濾，比較各濾液顏色，結(jié)果顯示，各顏色由深至淺依次為10 min淺棕色，20 min淺棕色，40 min淺黃略棕色，50min淺黃略棕色，60min淺黃色。離心取上清，測定吸光度，計(jì)算黃酮保留率及脫色率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同脫色時間下的脫色效果Fig.2 Effectsof tim eon decolorization

由圖2可知，脫色20min時，黃酮保留率及脫色率均較高，20min后黃酮保留率有下降趨勢，因此較佳脫色時間應(yīng)為20min左右。

2.3.4 活性炭用量對脫色效果的影響

設(shè)置溫度為50℃，脫色時間為20min，活性炭使用量分別為0.5%、1%、1.5%，2%、3%，磁力攪拌器攪拌后過濾，比較各濾液顏色，結(jié)果顯示，各顏色由深至淺依次為0.5%活性炭棕色，1%活性炭淺棕色，1.5%活性炭淺黃色，2%活性炭淺黃近無色，3%活性炭近無色。離心取上清，測定吸光度，計(jì)算黃酮保留率及脫色率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同活性炭用量下的脫色效果Fig.3 Effectsofactive carbon on decolorization

由圖3可知，隨著活性炭用量的增加脫色率逐漸升高，但黃酮含量逐漸降低，綜合考慮兩者的重要性，確定1%左右的活性炭為較佳添加量。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 因素水平選擇

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。各因素的水平設(shè)計(jì)如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab le1 L9（34）orthogonal test design

2.4.2 正交試驗(yàn)及數(shù)據(jù)處理

將馬齒莧總黃酮用20%乙醇水配制成4mg/mL的溶液，按表1所述正交試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)。各脫色液過濾除去活性炭，比較濾液的顏色。離心取上清，測定吸光度，以黃酮保留率和脫色率為衡量脫色效果的考察指標(biāo)，采用加權(quán)評分法對各脫色的效果進(jìn)行評分[14]，權(quán)重系數(shù)均為0.5，分別把兩個考察指標(biāo)中的最大值定為100分，綜合評分按下式進(jìn)行計(jì)算，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表2 直觀分析表Tab le2 Analysisof L9（34）test results

表3 方差分析表Tab le3 Varianceanalysis

綜合評分=（黃酮保留率/83.67%×100×0.5）+（脫色率/84.81%×100×0.5）

其中83.67%為黃酮保留率的最大值，84.81%為脫色率的最大值，由表2、表3可知，活性炭用量對脫色效果影響最為顯著（P＜0.05），脫色溫度和脫色時間影響較小。根據(jù)表2的k值結(jié)果得出馬齒莧黃酮活性炭脫色的最佳工藝應(yīng)為活性炭用量0.5%，脫色時間40min，脫色溫度60℃。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫色效果不如試驗(yàn)9中1%活性炭效果佳，結(jié)合產(chǎn)品研發(fā)對色澤的要求，最終選擇最佳工藝為A3B3C2，即在60℃，加入1%活性炭，攪拌脫色40min，此時馬齒莧黃酮保留率為57.11%，脫色率為79.19%。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取3份云南昆明的馬齒莧黃酮各40mg，用20%乙醇水溶液定容至10mL容量瓶中，用選定的最佳脫色工藝進(jìn)行脫色試驗(yàn)，脫色后的濾液呈淺黃色，脫色率均值為78.45%，相對偏差為1.74%，黃酮保留率均值為58.95%，相對偏差為1.35%，表明該最佳脫色工藝可行可靠。

2.4.4 不同產(chǎn)地馬齒莧總黃酮脫色前后對比

選取來自廣西玉林、安徽亳州、河南鄭州的馬齒莧，按2.1所述方法進(jìn)行提取分離后，得到總黃酮浸膏，用選定的最佳脫色工藝進(jìn)行脫色后，測定其黃酮保留率及脫色率，結(jié)果見表4。

表4 3個產(chǎn)地馬齒莧總黃酮的活性炭脫色效果Table4 Effectsof decolorization of Portulaca oleracea L.in three areas %

由表4可知，3個產(chǎn)地的馬齒莧總黃酮含量差異明顯，脫色前安徽亳州的馬齒莧黃酮含量最高，廣西玉林的含量最低。用選定的方法進(jìn)行脫色后，3個樣品黃酮保留率均大于57%，3個樣品脫色后顏色均顯著變淺，脫色率均大于69%以上，表明本研究選定的最佳脫色工藝可以用于不同產(chǎn)地的馬齒莧總黃酮脫色。

3 結(jié)論與討論

馬齒莧總黃酮被廣泛使用在食品、藥品、化妝品領(lǐng)域里[10]，然而因?yàn)槠漕伾^深，一定程度影響到成品的質(zhì)量，給使用帶來許多不便。在本研究中，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的試驗(yàn)方案8所得的綜合得分與選定的最佳工藝（試驗(yàn)方案9）得分相近，方案8和9在實(shí)際應(yīng)用中側(cè)重點(diǎn)會有所不同，在本文中，因方案8的脫色效果不夠顯著，顏色略深，故最終選定方案9為最佳脫色工藝，即在60℃，加入1%活性炭，攪拌脫色40min，此時的黃酮保留率為57.11%，脫色率為79.19%，經(jīng)過3個批次樣品的驗(yàn)證，脫色方案穩(wěn)定、可靠。該方案在保留有效成分總黃酮的同時，盡可能脫去了顏色的干擾，有利于馬齒莧進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。

本研究還用選定的最佳脫色條件考察了其它3個產(chǎn)地馬齒莧總黃酮脫色前后的差異。結(jié)果顯示，用選定的方案脫色后，3個產(chǎn)地的總黃酮保留率均大于57%，脫色率均大于69%，由于不同產(chǎn)地馬齒莧所含成分存在差異，因此脫色效果也存在一定的差異。來自廣西玉林和河南鄭州的馬齒莧脫色效果與云南馬齒莧較一致，為淺黃色，安徽亳州的馬齒莧總黃酮含量較高，脫色后顏色較其它兩地的稍深，為淺黃棕色，亦達(dá)到預(yù)期要求，因此本研究的脫色工藝為不同產(chǎn)地馬齒莧總黃酮的提取和脫色提供了方法和借鑒意義，同時為馬齒莧總黃酮的純化、深度挖掘和開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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