血清miR-21、miR-92聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌診斷效能分析及術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

華紅，郝貴亮，韓彩惠，解童玲，姚魯璐

(1 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東青島266033；2 青島市婦女兒童醫(yī)院)

癌胚抗原(CEA)、糖類抗原CA199是目前臨床上結(jié)直腸癌早期篩查及術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移監(jiān)測的常用腫瘤標(biāo)志物，但其診斷結(jié)直腸癌的敏感性僅為50%～65%，且預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的效果亦不理想，遠(yuǎn)不能滿足臨床需求[1，2]。微小RNA(miRNA)是一組高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，可通過結(jié)合到mRNA的3′非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄或降解，從而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為[3]。miRNA不僅存在于細(xì)胞中，還可以cell-free miRNA形式存在于血液中，被稱為循環(huán)miRNA[4～6]。循環(huán)miRNA在反復(fù)凍融條件下仍能保持穩(wěn)定，有作為腫瘤標(biāo)志物的潛能[7～11]。miR-21、miR-92是miRNA家族中的成員。miR-21的編碼基因定位于染色體17q23.2[12]。miRNA-92是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其編碼基因定位于染色體13q31.3[13]。已有研究證實，結(jié)直腸癌患者外周血miR-21、miR-92水平上調(diào)[14]。但二者能否作為結(jié)直腸癌篩查的腫瘤標(biāo)志物尚不清楚。本研究探討血清miR-21、miR-92聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌診斷效能及術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。

1 臨床資料

1.2 血清miR-21、miR-92水平檢測及結(jié)果分析 結(jié)直腸癌組于術(shù)前及術(shù)后1個月，對照組于體檢日，采集清晨空腹外周靜脈血5 mL，靜置30 min，室溫3 000×g離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用miRNeasy血清/血漿試劑盒提取血清總RNA，采用NanoDrop Lite分光光度儀鑒定總RNA純度，A260/A280為1.9～2.1，說明提取的總RNA純度合格，符合實驗要求。取總RNA 1 μL，嚴(yán)格按miscriptⅡRT試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按miscript SYBR Green PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：miR-21上游引物5′-GCGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；miR-92上游引物5′-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′，下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 10 μL，5×miscript逆轉(zhuǎn)錄混合液4 μL，上下游引物各2 μL，無RNA酶水2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s共40個循環(huán)，最后70 ℃ 30 s。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21、miR-92相對水平。實驗重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，對照組血清miR-21、miR-92相對水平分別為1.00±0.25、1.00±0.19，結(jié)直腸癌組術(shù)前血清miR-21、miR-92相對水平分別為9.63±3.12、6.50±2.59，兩組比較P均<0.01。結(jié)直腸癌組術(shù)后復(fù)發(fā)者與未復(fù)發(fā)者術(shù)后1個月血清miR-21相對水平分別3.94±0.59、1.57±0.21，血清miR-92相對水平分別為2.77±0.42、1.24±0.37，二者比較P均<0.05。

1.3 血清miR-21、miR-92單獨或聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的效能分析 繪制血清miR-21、miR-92單獨或聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線，計算曲線下面積。結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-92單獨檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積分別為0.892(95%CI：0.819～0.918，P<0.01)、0.905(95%CI：0.827～0.935，P<0.01)，其cut off值分別為4.51、2.25，此時其診斷敏感性分別為85.4%、65.3%，特異性分別為80.3%、90.1%。二者聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積為0.973(95%CI：0.927～0.991，P<0.01)，敏感性為81.3%，特異性為96.1%。見圖1。

1.4 血清miR-21、miR-92單獨或聯(lián)合檢測預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的效能分析 繪制血清miR-21、miR-92單獨或聯(lián)合檢測預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線，計算曲線下面積。結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-92單獨檢測預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積分別為0.802(95%CI：0.769～0.837，P<0.01)、0.855(95%CI：0.805～0.915，P<0.01)，其cut off值分別為2.97、2.08，此時其預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的敏感性分別為79.9%、61.7%，特異性分別為76.2%、85.3%。二者聯(lián)合檢測預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積為0.957(95%CI：0.917～0.981，P<0.01)，敏感性為80.6%，特異性為95.3%。見圖2。

圖1 血清miR-21、miR-92單獨和聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

圖2 血清miR-21、miR-92單獨和聯(lián)合預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

2 討論

miRNA是一種分子進(jìn)化保守的非編碼小分子RNA，長度為17～25個核苷酸，在細(xì)胞核中合成，經(jīng)過Drosha酶復(fù)合體加工后，由輸出蛋白5轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核，在胞質(zhì)中進(jìn)一步經(jīng)過Dicer酶復(fù)合體的加工成為成熟的miRNA[15～18]。目前已發(fā)現(xiàn)1 000多種miRNA，一種miRNA可與數(shù)百甚至上千個mRNA互補結(jié)合，調(diào)控mRNA降解或沉默蛋白翻譯過程，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[19，20]。研究表明，miRNA可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等過程[21]，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。不同類型腫瘤有特異的miRNA表達(dá)譜[22]，目前miRNA作為腫瘤標(biāo)志物的價值備受關(guān)注。miRNA亦能在血液、尿液、乳汁、腦脊液等體液中被檢出[23]，而且循環(huán)miRNA在反復(fù)凍融的條件下仍能保持穩(wěn)定，有作為腫瘤標(biāo)志物的潛能。

結(jié)直腸癌患者外周血miR-21、miR-92水平上調(diào)。但二者能否作為結(jié)直腸癌早期篩查和術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的分子標(biāo)志物尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組術(shù)前血清miR-21、miR-92水平明顯高于對照組，術(shù)后復(fù)發(fā)者術(shù)后1個月血清miR-21、miR-92水平高于未復(fù)發(fā)者。說明循環(huán)miR-21、miR-92有可能作為篩查結(jié)直腸癌和預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-92單獨診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積、診斷敏感性均高于CEA、CA199[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤的特異性miRNA存在交叉性和多樣性，故單項miRNA檢測對結(jié)直腸癌的診斷可能無法達(dá)到理想的敏感性和特異性。本研究結(jié)果顯示，血清miR-21、miR-92聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積、敏感性及特異性均明顯高于二者單獨檢測；二者聯(lián)合檢測預(yù)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線下面積、敏感性及特異性亦均高于單獨檢測。說明二者聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌篩查和患者術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測的效能高于二者單獨檢測。

綜上所述，血清miR-21、miR-92可作為篩查結(jié)直腸癌和預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物，二者聯(lián)合檢測效能更佳。

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