食管鱗癌患者血漿lncRNA TUC338表達變化及其臨床意義

孫開顏，趙新煒，楊麗君，董翠翠，董樹嶺，尹惠卿，明亮，賀付成

(1 鄭州大學第一附屬醫(yī)院，鄭州450052；2 天津兒童醫(yī)院)

食管癌的主要組織學類型為鱗癌和腺癌，其中90%以上為鱗癌[1]。據(jù)統(tǒng)計，食管鱗癌(ESCC)早期診治者5年生存率可超過90%[2～4]。但目前臨床上缺少早期診斷敏感、特異的無創(chuàng)性診斷技術或指標。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種沒有編碼功能、長度大于200 nt的功能性RNA分子，其不編碼蛋白質，而是以RNA的形式在表觀遺傳調控、基因轉錄調節(jié)、轉錄后加工等方面調控基因表達[5]。在體內，lncRNA可參與多種生物學過程的調控，在細胞分化、胚胎與組織發(fā)育等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[6～8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血漿lncRNA水平特異性變化與病情進展有關，可能作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9～11]。推測lncRNA有可能成為一種ESCC早期診斷的非侵入性腫瘤生物標志物。本研究觀察了ESCC患者血漿lncRNA TUC338表達變化，并分析lncRNA TUC338早期診斷ESCC的潛在價值，旨在為尋找新的腫瘤生物標志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2017年1月鄭州大學第一附屬醫(yī)院收治的ESCC患者116例(ESCC組)。所有患者經(jīng)消化內鏡活檢或術后組織病理檢查明確診斷，術前未接受任何抗腫瘤治療。排除伴發(fā)器質性或系統(tǒng)性疾病，如糖尿病、高血壓等，以及合并其他腫瘤者。其中，男56例、女60例，年齡45～84(65.76±7.83)歲；腫瘤直徑：≤3 cm 54例，>3 cm 62例；腫瘤部位：胸上段41例，胸中段39例，胸下段36例；組織分化程度：高中分化65例，低未分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期63例；有淋巴結轉移59例，無淋巴結轉移57例。同期另選在本院體檢的健康者39例(對照組)，男21例、女18例，年齡44～85(65.62±7.24)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 血漿和食管組織lncRNA TUC338表達檢測 ①樣本收集與處理：ESCC組于術前、對照組于體檢日采集空腹靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，靜置20 min，3 000 r/min離心10 min，小心將上層血漿轉移至新的EP管中，12 000 r/min離心10 min，將上層血漿再次轉移至新的EP管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。另選ESCC組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，置于RNA保存液中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＂谘獫{和食管組織總RNA提?。喝∩鲜鲅獫{250 μL，加入TRIzol LS 750 μL，充分混勻，按照TRIzol LS試劑盒說明提取總RNA；取癌組織及其配對的癌旁正常組織各30 mg，液氮下研磨成粉末，然后加入TRIzol 1 mL，充分混勻，按照TRIzol試劑盒說明提取總RNA。經(jīng)NanoDrop 2000C紫外分光光度計檢測，OD260/OD280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格，調整總RNA濃度至300 ng/μL進行后續(xù)實驗。③逆轉錄反應：將總RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明逆轉錄為cDNA，所得cDNA -20 ℃保存。④實時熒光定量PCR：lncRNA TUC338及其內參GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。引物序列：lncRNA TUC338上游引物5′-TCCACAGGACAGGTACAGCA-3′，下游引物5′-GCCTTGGAGACTGAACATCC-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。取cDNA 2 μL，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.4 μL；反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、58 ℃退火34 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA TUC338相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 相關性分析 隨機選擇46例ESCC患者，采用Spearman秩相關分析法分析血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達的關系。分析血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關系。

1.4 血漿lncRNA TUC338表達對ESCC的診斷效能分析 繪制血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的受試者工作特征(ROC)曲線，計算曲線下面積。以cut off值為截斷值，計算血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的敏感性及特異性。

2 結果

2.1 兩組血漿lncRNA TUC338表達比較 ESCC組及對照組血漿lncRNA TUC338相對表達量分別為2.60±0.83、1.03±0.32，二者比較P<0.01。

2.2 ESCC組織及癌旁正常組織lncRNA TUC338表達比較 ESCC組織及癌旁正常組織lncRNA TUC338相對表達量分別為2.47±0.69、1.02±0.29，二者比較P<0.01。

2.3 ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達的關系 Spearman秩相關分析顯示，ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達呈正相關關系(r=0.643，P<0.01)。

2.4 血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關系 見表1。

表1 血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關系

2.5 血漿lncRNA TUC338表達對ESCC的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的曲線下面積為0.684(95%CI： 0.567～0.780，P<0.01)，其cut off值為1.415，此時其診斷ESCC的敏感性為63.4%、特異性為78.1%。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在血液中穩(wěn)定性較高，可通過包被在外泌體、微泡等微粒中免于被核糖核酸酶降解，而且在室溫下放置24 h以上甚至反復凍融亦相當穩(wěn)定[12]。與miRNA一樣，lncRNA亦能存在于腫瘤患者尿液、唾液和血液中[13]，如lncRNA HOTTIP-005在胰腺癌患者血漿中異常表達，可作為胰腺癌診斷和患者預后判斷的潛在生物標志物[14]；lncRNA-HEIH在肝細胞癌患者血漿中高表達，其表達變化與肝細胞癌病情進展有關，可用于肝癌的早期診斷以及患者預后監(jiān)測[15]。因此，血漿中某些核酸分子水平變化有助于腫瘤的診斷[16]。但血漿lncRNA能否作為ESCC早期診斷的生物標志物尚不十分清楚。

人TUC338序列全長590 bp，基因位于12號染色體。多聚胞嘧啶結合蛋白2基因獨立轉錄形成UC338轉錄片段，TUC338為克隆該轉錄片段而來。Braconi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TUC338在人肝細胞癌中表達顯著增加，沉默TUC338表達可抑制肝癌細胞生長。牟麗莎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，應用RNAi技術下調TUC338表達可使膀胱癌細胞凋亡增加，推測TUC338可作為膀胱癌藥物治療潛在的作用靶點。Ouyang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TUC338表達后，CAL-27和SCC-9兩種舌鱗癌細胞增殖均受到抑制，細胞凋亡增加，說明TUC338可參與舌鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果顯示，ESCC組血漿lncRNA TUC338相對表達量明顯高于對照組；ESCC組織lncRNA TUC338相對表達量明顯高于癌旁正常組織。提示lncRNA TUC338可能在ESCC發(fā)生、發(fā)展過程中具有癌基因作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達呈正相關關系，說明血漿lncRNA TUC338表達可反映腫瘤組織lncRNA TUC338表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，血漿lncRNA TUC338表達與ESCC組織TNM分期有關。腫瘤惡性程度越高，血漿lncRNA TUC338表達越高，提示血漿lncRNA TUC338可能參與ESCC的惡性轉化。本研究ESCC有淋巴結轉移者血漿lncRNA TUC338表達高于無淋巴結轉移者，提示血漿lncRNA TUC338可能參與ESCC的侵襲和轉移。本研究ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA TUC338診斷ESCC的敏感性為63.4%、特異性為78.1%，提示血漿lncRNA TUC338有可能作為診斷ESCC的潛在生物標志物。但由于本研究樣本量較少，其結論還有待于進一步研究證實。

綜上所述，ESCC患者血漿LncRNA TUC338高表達，其表達變化與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關；血漿LncRNA TUC338有可能作為診斷ESCC的潛在生物標志物。

參考文獻：

[1] Rustgi AK, El-Serag HB. Esophageal carcinoma[J]. N Engl J Med, 2014,371(26):2499-2509.

[2] Hong L, Han Y, Zhang H, et al. Prognosis-related microRNAs in esophageal cancer[J]. Expert Opin Biol Ther, 2014,14(4):483-489.

[3] Zhang HL, Liu RL, Shi YT, et al. Analysis of the survival in patients after surgical resection of thoracic esophageal cancer[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2009,31(7):541-545.

[4] Pennathur A, Gibson MK, Jobe BA, et al. Oesophageal carcinoma[J]. Lancet, 2013,381(9864):400-412.

[5] Shen Z, Li Q, Deng H, et al. Long non-coding RNA profiling in laryngeal squamous cell carcinoma and its clinical significance: potential biomarkers for LSCC[J]. PLoS One, 2014,9(9):e108237.

[6] Ge Y, Yan X, Jin Y, et al. MiRNA-192 [corrected] and miRNA-204 Directly Suppress lncRNA HOTTIP and Interrupt GLS1-Mediated Glutaminolysis in Hepatocellular Carcinoma[J]. PLoS Genet, 2015,11(12):e1005726.

[7] Sahu A, Singhal U, Chinnaiyan AM. Long noncoding RNAs in cancer: from function to translation[J]. Trends Cancer, 2015,1(2):93-109.

[8] Mehta SL, Kim T, Vemuganti R. Long noncoding RNA fosDT promotes ischemic brain injury by interacting with REST-associated chromatin-modifying proteins[J]. J Neurosci, 2015,35(50):16443-16449.

[9] Tong YS, Wang XW, Zhou XL, et al. Identification of the long non-coding RNA POU3F3 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Cancer, 2015(14):3.

[10] Rivas A, Burzio V, Landerer E, et al. Determination of the differential expression of mitochondrial long non-coding RNAs as a noninvasive diagnosis of bladder cancer[J]. BMC Urol, 2012(12):37.

[11] Shao Y, Ye M, Jiang X, et al. Gastric juice long noncoding RNA used as a tumor marker for screening gastric cancer[J]. Cancer, 2014,120(21):3320-3328.

[12] Huang X, Yuan T, Tschannen M, et al. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing[J]. BMC Genomics, 2013(14):319.

[13] Hauptman N, Glavac D. Long non-coding RNA in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(3):4655-4669.

[14] Wang Y, Li Z, Zheng S, et al. Expression profile of long non-coding RNAs in pancreatic cancer and their clinical significance as biomarkers[J]. Oncotarget, 2015,6(34):35684-35698.

[15] 楊哲鋒，李娟，馬志元，等.血漿LncRNA-HEIH表達水平與肝癌發(fā)病風險的關聯(lián)分析[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2015，23(1)：80-84.

[16] Wang J, Zhang KY, Liu SM, et al. Tumor-associated circulating microRNAs as biomarkers of cancer[J]. Molecules, 2014,19(2):1912-1938.

[17] Braconi C, Valeri N, Kogure T, et al. Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(2):786-791.

[18] 牟麗莎，朱書，蔡志明.TUC338在膀胱癌中的表達及作用機制研究[J].深圳中西醫(yī)結合雜志，2016，26(20)：1-3.

[19] Ouyang KX, Zou R, Liang J, et al. TUC338 overexpression leads to enhanced proliferation and reduced apoptosis in tongue squamous cell carcinoma cells in vitro[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2017,75(2):423-428.