阿帕替尼對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤生長及生物鐘基因表達(dá)的影響

何曉曉，熊枝繁，邱夢(mèng)君，占靜，陳仁旺，楊盛力

(1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

近年來肝癌的發(fā)病率不斷升高，全球每年新發(fā)病例超過700 000例[1]。生物鐘是細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生和維持的，它不依賴于外界因素維持著機(jī)體的時(shí)間節(jié)律性，其作用在于產(chǎn)生和控制晝夜生物節(jié)律的運(yùn)轉(zhuǎn)。研究證實(shí)，生物鐘對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有調(diào)控作用[2]。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)多個(gè)生物鐘基因已被確認(rèn)，如CLOCK、BMAL1、CKIε、Per(Per1、Per2、Per3)、Cry(Cry1、Cry2)、DEC和NPAS2等[3,4]。阿帕替尼是一種新型的小分子抗血管生成劑，能夠靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)酪氨酸激酶活性，繼而抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。有研究證實(shí)，阿帕替尼靶向治療晚期胃癌或肝癌的臨床療效較好[6，7]，并可延長患者總生存期[8]。Yu等[9]研究認(rèn)為，生物鐘基因是一種潛在的抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。Lin等[10，11]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞或組織中存在某些生物鐘基因表達(dá)紊亂，如Per、Cry等。但目前阿帕替尼靶向治療肝癌能否影響生物鐘基因的表達(dá)尚不清楚。2017年3～5月，本研究觀察了阿帕替尼對(duì)人肝癌裸鼠皮下移植瘤生長及生物鐘基因表達(dá)的影響?，F(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c裸鼠16只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量16～23 g，SPF條件下分籠喂養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞株HepG2(以下稱HepG2細(xì)胞)，購自中國典型物種保藏中心，液氮中保存。甲磺酸阿帕替尼片，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用10% DMSO溶解，制成終濃度為0.2 g/mL溶液。所有PCR引物由美國Life Technologies公司設(shè)計(jì)合成。CO2培養(yǎng)箱，美國Harris公司；熒光定量PCR儀，美國Ambion公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；低溫高速離心機(jī)，德國Heraeus公司。RPMI 1640、FBS、胰酶，美國Hyclone公司；DMSO，美國MP Biomedicals公司；TRIzol、SYBR?Green PCR Master Mix，美國Life Technologies公司。

1.2 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型建立 HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每2～3天換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時(shí)，以1∶3比例傳代。收集傳3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，用PBS緩沖液制成密度為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液0.2 mL，接種于裸鼠右腋皮下，放回籠中，繼續(xù)在SPF條件下喂養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物分組處理 所有裸鼠接種HepG2細(xì)胞后，每日觀察一般狀況、接種部位液體吸收及成瘤情況。接種3天左右，所有裸鼠右腋皮下接種部位出現(xiàn)3～5 mm的腫瘤結(jié)節(jié)。隨著腫瘤結(jié)節(jié)體積的增加，所有裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)遲緩，食欲、體質(zhì)量較接種前明顯降低。至接種1周，所有裸鼠腫瘤結(jié)節(jié)體積達(dá)100 mm3左右，隨機(jī)將裸鼠分為阿帕替尼組、對(duì)照組，每組8只。阿帕替尼組給予阿帕替尼50 mg/kg灌胃，對(duì)照組給予DMSO 100 μL/20 g灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃2周。兩組治療期間均無死亡。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 腫瘤體積 兩組灌胃治療期間每隔2天用用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大徑(a)和最小徑(b)。分別于灌胃治療前，灌胃治療第3、6、9、12天以及灌胃結(jié)束24 h，計(jì)算腫瘤體積(V)。V(mm3)=ab2/2。

1.4.2 Per、CLOCK、Cry、BMAL1、CKIε mRNA表達(dá) 采用Real-time PCR法。末次灌胃結(jié)束24 h，頸椎脫臼法處死，剝離瘤體，置于液氮中，-80 ℃冰箱凍存。取兩組凍存腫瘤組織各100 mg，TRIzol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計(jì)鑒定總RNA純度，OD260/OD280為1.7～2.0，表明提取的總RNA純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：Per1上游引物5′-AGGCAACGGCAAGGACTC-3′，下游引物5′-GGCTGTAGGCAATGGAACTG-3′，溫度60.2 ℃，產(chǎn)物大小101 bp；Per2上游引物5′-CTACAGCAGCACCATCGTC-3′，下游引物5′-CCACTCGCAGCATC-TTCC-3′，溫度58.9 ℃，產(chǎn)物大小78 bp；Per3上游引物5′-TGGTGGTGGTGAATGTAAGAC-3′，下游引物5′-GGCTGTGCTCATCGTTCC-3′，溫度57.2 ℃，產(chǎn)物大小104 bp；Cry1上游引物5′-CAACCTCCATTCATCTTTCC-3′，下游引物5′-CTCATAGCCGACACCTTC-3′，溫度58.9 ℃，產(chǎn)物大小151 bp；Cry2上游引物5′-TGGGCTTCTGGGACTGAG-3′，下游引物5′-GGTAGGTGTGCTGTCTTAGG-3′，溫度57.2 ℃，產(chǎn)物大小136 bp；CLOCK上游引物5′-GCAGCAGCAGCAGCAGAG-3′，下游引物5′-CAGCAGAGAGAATGA-GTTGAGTTG-3′，溫度61.9 ℃，產(chǎn)物大小149 bp；BMAL1上游引物5′-TGCCACCAATCCATACACAGA-AG-3′，下游引物5′-TTCCCTCGGTCACATCCTACG-3′，溫度60.9 ℃，產(chǎn)物大小123 bp；CKIε：上游引物5′-TCAGCGAGAAGAAGATGTC-3′，下游引物5′-GA-AGAGGTTGCGGAAGAG-3′，溫度58.9 ℃，產(chǎn)物大小149 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物5′-GCTCGCTCCA-ACCGACTGC-3′，溫度60.0 ℃，產(chǎn)物大小171 bp。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)體系共25 μL：SYBRGreen Mix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 2 min、59 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min共33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組灌胃不同時(shí)間移植瘤體積變化 見表1。

表1 兩組灌胃不同時(shí)間移植瘤體積比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間比較，*P<0.05。

2.2 兩組移植瘤組織生物鐘基因Per、CLOCK、Cry、BMAL1、CKIε mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 兩組移植瘤組織Per、CLOCK、Cry、BMAL1、CKIε mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

血管生成是許多腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，故抑制血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路是抗腫瘤治療的有效靶點(diǎn)之一。阿帕替尼為VEGFR-2小分子抑制劑，主要用于標(biāo)準(zhǔn)化療后仍有進(jìn)展的晚期胃癌患者。研究證實(shí)，阿帕替尼具有廣譜抗實(shí)體瘤效果，可用于胃癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的靶向治療[12]。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼組從灌胃第3天開始腫瘤體積明顯低于對(duì)照組，說明阿帕替尼能抑制腫瘤生長，進(jìn)一步驗(yàn)證了阿帕替尼的抗腫瘤效果，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致。

研究證實(shí)，生物鐘基因突變與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其是腹部惡性腫瘤患者生物鐘基因普遍存在異常表達(dá)[14]。腫瘤細(xì)胞中生物鐘基因Per、Cry通常處于低表達(dá)狀態(tài)[15，16]；當(dāng)這些生物鐘基因過表達(dá)時(shí)，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[17，18]。生物鐘基因CLOCK在腫瘤組織中多呈過表達(dá)狀態(tài)，其過表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[19]。目前CKIε表達(dá)與惡性腫瘤的關(guān)系尚不十分清楚。Kou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些生物鐘基因，如Per、Cry、CLOCK、BMAL1等，可影響VEGF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。生物鐘基因表達(dá)紊亂及其引起的代謝紊亂是肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生的重要原因之一[2]。阿帕替尼作為VEGFR-2抑制劑，是否通過調(diào)控生物鐘基因表達(dá)來抑制腫瘤血管生成，繼而達(dá)到抗腫瘤目的尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼組移植瘤組織Per3、CLOCK、CKIε、Cry2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組。表明阿帕替尼的抗腫瘤效果可能與抑制上述生物鐘基因表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，阿帕替尼能抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤生長，其機(jī)制可能與下調(diào)腫瘤細(xì)胞生物鐘基因Per3、CLOCK、Cry2、CKIε mRNA表達(dá)有關(guān)。

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