短擴增子對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移石蠟組織LncRNA定量分析的可行性

李佳茜，孫青

(1 濰坊醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東濰坊261000；2 山東省千佛山醫(yī)院)

篩選、鑒定與腫瘤轉(zhuǎn)移相關的分子是當前腫瘤學研究的熱點。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。LncRNA具有數(shù)量多、類型多、作用模式多等特點，根據(jù)其生物學功能分為信號分子、誘餌分子、引導分子和支架分子。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可通過染色體修飾、X染色體沉默、DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄激活或沉默等方式，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳學水平進行調(diào)控，繼而參與機體多種生理或病理過程[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[3,4]。手術(shù)切除組織或活檢組織最常用的保存方式是甲醛固定后石蠟包埋[5]。但石蠟包埋組織(以下稱石蠟組織)保存過程中核酸會發(fā)生部分降解，Masuda等[6]發(fā)現(xiàn)石蠟組織提取的mRNA片段長度平均約200 bp，故分析其LncRNA有一定困難[7]。在實時熒光定量PCR(qRT-PCR)過程中，短擴增子非常穩(wěn)定且可檢測，可對石蠟組織來源的LncRNA進行有效擴增[8～12]。但其對LncRNA定量分析的可行性仍待進一步驗證。本研究篩選出與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關的LncRNA，在石蠟組織中通過PCR擴增短擴增子，旨在探索短擴增子用于定量分析石蠟組織LncRNA的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2012年1月～2015年1月山東省千佛山醫(yī)院病理科保存的結(jié)直腸癌石蠟組織55例份，2015年1月～2017年1月保存的結(jié)直腸癌冰凍組織40例份，每份標本包含結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，均經(jīng)組織病理檢查證實。標本來源患者均為首次手術(shù)治療，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療，預計生存期≥6個月，排除既往存在其他部位惡性腫瘤史、有遠處轉(zhuǎn)移及合并重要臟器嚴重疾病者。本研究經(jīng)山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關LncRNA篩選 本課題組前期通過高通量LncRNA芯片進行差異篩選，確定了4條與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關LncRNA，即LncRNA-Enst00000554679、LncRNA-Enst00000550851、LncRNA-Enst00000497498、LncRNA-Enst00000513016。

1.3 LncRNA表達檢測 選擇冰凍組織25例份，采用qRT-PCR法分別檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織上述與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關的4條LncRNA表達。①RNA提取：取3種冰凍組織各100 mg，勻漿后按RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(離心柱型)說明提取組織總RNA，通過gDNA Eliminator column去除基因組DNA。經(jīng)NanoDrop@ND.1000微量核酸定量儀定量，OD260/OD280為1.8～2.1，說明提取的總RNA純度合格，可用于后續(xù)實驗。②逆轉(zhuǎn)錄反應：按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，- 20 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應體系共20 μL：總RNA 10 μL，Random Hexamer 1 μL，Nuclease-Free Water 1 μL，5× Reaction Buffer 4 μL，Ribo Lock RNAse inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Revert Aid Reverse Transcriptase 1 μL。③引物設計合成：所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，并通過高親和力純化進行片段提純。按一般原則設計4對長引物用于擴增LncRNA內(nèi)的長片段。LncRNA-Enst00000554679：上游引物5′-AAAGAAGTAAACACAAGAC-3′，下游引物5′-AAAATGTTACATCAGGGAG-3′；LncRNA-Enst-00000550851：上游引物5′-ACCGTCTGCAATCAGTTAC-3′，下游引物5′-ATCATGTCAGAGAGCCTGG-3′；LncRNA-Enst00000497498：上游引物5′-CTGAGCAGAAACCAAGTTG-3′，下游引物5′-CTAAAACAG-CTTCACATGG-3′；LncRNA-Enst00000513016： 上游引物5′-TTGAGAAGATGTTGATGAC-3′，下游引物5′-TTATAGCCCTTTTACATTG-3′；內(nèi)參β-actin：上游引物5′-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3′， 下游引物5′-TCTCTTGCTCGAAGTCCAGG-3′。④PCR擴增：PCR反應體系共20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，50×Rox reference dye 0.4 μL，Water nuclease-free 3.6 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL；反應條件：95 ℃預變性60 s，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s共40個循環(huán)。每個樣本設3個復孔。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 短擴增子和長擴增子擴增效率評估 采用qRT-PCR法。選擇冰凍組織和石蠟組織各5例份，采用1.2中方法提取結(jié)直腸癌組織總RNA。為消除個體差異的干擾，將從冰凍組織和石蠟組織提取的結(jié)直腸癌組織總RNA混合，分別使用配對的長、短擴增子擴增，繪制4條LncRNA和內(nèi)參β-actin的標準曲線。根據(jù)標準曲線計算擴增子的擴增效率和測定系數(shù)(R2)。設計4對短引物，每條LncRNA與1.3中各LncRNA長引物共享上游引物序列。LncRNA-Enst00000554679(short-A)：下游引物5′-AATCAAGCAAGTGGAAATG-3′，LncRNA-Enst00000550851(short-A)：下游引物5′-ATGGAAGTTGCCTGTTTAC-3′，LncRNA-Enst00000497498(short-A)：下游引物5′-ACCCAAACAACTCACAACG-3′，LncRNA-Enst00000513016(short-A)：下游引物5′-TATAGACCTTTATCCTTCC-3′。內(nèi)參β-actin的上下游引物同1.3。其余步驟同1.3。

1.5 短擴增子和長擴增子定量一致性評估 選擇冰凍組織和石蠟組織各10例份，采用qRT-PCR法檢測短擴增子和長擴增子擴增后靶LncRNA表達，具體步驟同1.3、1.4。分析結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織與結(jié)直腸癌組織靶LncRNA擴增循環(huán)數(shù)(Ct)的比值，>2.0為靶LncRNA表達上調(diào)，<0.5為靶LncRNA表達下調(diào)，0.5～2.0為靶LncRNA表達無明顯變化。分析冰凍組織中短擴增子和長擴增子的定量一致性以及冰凍組織和石蠟組織短擴增子的定量一致性。

1.6 短擴增子對石蠟組織中LncRNA定量分析的可靠性評估 分別為4條LncRNA設計3對短擴增子引物(short-A、Short-B、Short-C)，short-A同1.4。另外2個短擴增子引物序列：LncRNA-Enst0000055-4679：short-B上游引物5′-CTCATGGAAACAAGCAC-TG-3′，下游引物5′-TGCCAGATACCTGTCATTG-3′；short-C上游引物5′-TGAATGCTACAGCCCTATG-3′，下游引物5′-GCCAGCAGTAACATTGTTG-3′。LncRNA-Enst00000550851：short-B上游引物5′-GACTTTAACTGGAGCACAG-3′，下游引物5′-TGATACGCACAGCACTTGG-3′；short-C上游引物5′-GATCCTGGTAACAAATGGC-3′，下游引物5′-TTTTGGCATCCATA-TTGGG-3′。LncRNA-Enst00000497498：short-B上游引物5′-CCCTATTTTAAGCCATGTG-3′，下游引物5′-TACGTGTCCTAACCATGTG-3′；short-C上游引物5′-ACGTTTGAAATGTGCGCTC-3′，下游引物5′-AGGTAAGTTTGCATGACAC-3′。 LncRNA-Enst00000513016：short-B上游引物5′-TTTCTTCTGTCATACACTG-3′，下游引物5′-ACACTCAAATCACTCATTC-3′；short-C上游引物5′-TTCTGTCACATACACTCCC-3′，下游引物5′-CTATTAGGGTAACTGCTTC-3′。內(nèi)參β-actin的上下游引物同1.3。選擇40例份石蠟組織，采用qRT-PCR法檢測3個短擴增子擴增后靶LncRNA表達，具體步驟同1.3、1.4。分析石蠟組織中3個短擴增子的定量一致性，方法同1.5。

2 結(jié)果

2.1 不同冰凍組織4條LncRNA表達比較 見表1。

表1 不同冰凍組織4條LncRNA相對表達量比較

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05；與結(jié)直腸癌組織比較，#P<0.05。

2.2 冰凍組織與石蠟組織擴增效率評估 在冰凍組織中，4條LncRNA的短擴增子擴增效率為(101.0±3.1)%，達到最佳擴增效率(90%～110%)；長擴增子擴增效率為(176.0±30.9)%，未達到最佳擴增效率；短擴增子的R2為0.998±0.004，長擴增子為0.831±0.101，二者比較P<0.05。在石蠟組織中，4條LncRNA的短擴增子擴增效率為(102.0±3.7)%，達到最佳擴增效率；長擴增子擴增效率為(329.0±192.0)%，未達到最佳擴增效率；短擴增子的R2為0.987±0.013，長擴增子為0.607±0.221，二者比較P<0.05。

2.3 冰凍組織與石蠟組織短擴增子和長擴增子對LncRNA定量一致性評估 見表2、3。經(jīng)分析，在冰凍組織中短擴增子和長擴增子的定量一致性為62.5%；冰凍組織與石蠟組織短擴增子的定量一致性僅為25.0%。

2.4 石蠟組織中短擴增子對LncRNA定量分析的可靠性評估 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，4條LncRNA中3個短擴增子Ct變化趨勢一致率為37.5%，2個短擴增子Ct變化趨勢一致率達到100%。

表2 冰凍組織4條LncRNA短擴增子和長擴增子Ct比較

注：與短擴增子比較，*P<0.05。

表3 冰凍組織與石蠟組織4條LncRNA短擴增子Ct比較

注：兩種組織短擴增子Ct比較P均>0.05。

3 討論

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，居民膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的變化，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率和病死率分別居所有惡性腫瘤的第3位和第4位[13]。雖然目前對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制的研究已經(jīng)取得了許多新進展，但其預后差仍是當前面臨的嚴峻問題。侵襲和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預后不良的主要原因[14]。因此，探索結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，對其早期診斷及靶向治療至關重要。

LncRNA是一類長度大于200 bp、不具備翻譯成蛋白質(zhì)能力但可調(diào)控基因表達的一類RNA。一直以來，LncRNA被認為是進化過程中累積的“垃圾序列”，不具備任何生物學功能。隨著對整個轉(zhuǎn)錄組的分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[15，16]。有研究證實，LncRNA可在染色體修飾、轉(zhuǎn)錄前后多個層面上對基因表達、剪接等進行調(diào)控，進而參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[17～19]。此外，LncRNA的組織特異性使其在診斷中的敏感性明顯高于蛋白質(zhì)編碼的RNA、DNA或蛋白質(zhì)標記物[20]。本課題組前期利用高通量基因芯片技術(shù)，篩選出4條與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關的LncRNA，并發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中相對表達量明顯升高。據(jù)此推測這4條LncRNA可能作為癌基因參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

石蠟組織是生物醫(yī)學研究的重要資源，在醫(yī)學研究中具有不可替代的作用。但石蠟組織中分離的核酸通常會發(fā)生化學結(jié)構(gòu)斷裂或化學性質(zhì)改變[21，22]，加上固定液的化學修飾以及各種酶的破壞等，故用長擴增子進行PCR定量時效果欠佳。近年研究發(fā)現(xiàn)，短擴增子也可用于PCR定量[12]。石蠟組織中LncRNA發(fā)生不同程度降解的情況是無法得到糾正的，這種降解削弱了擴增子定量的可靠性。如果基因斷裂發(fā)生在擴增子序列或引物序列中則會導致擴增失敗，并使定量的可靠性進一步降低。因此，無論使用一個長或短擴增子，在冰凍組織和石蠟組織中都不能準確地驗證LncRNA表達。本研究我們采用3個非重疊的短擴增子進行qRT-PCR檢測，從石蠟組織中獲取LncRNA的可靠定量數(shù)據(jù)，從而使在石蠟組織中定量分析LncRNA成為可能。

擴增效率是顯示擴增子是否有效的重要指標。前期研究證實，擴增子的長短可影響LncRNA定量分析[8]。本研究在引物設計方面，讓短擴增子和相應的長擴增子共享引物序列，即短擴增子就是長擴增子的一部分片段。通常認為，PCR擴增的最佳效率為90%～110%。如果擴增子的擴增效率較低，表明相應的引物幾乎不起作用；而擴增效率較高，則表明可能存在PCR抑制[23]。本研究結(jié)果顯示，長擴增子在冰凍組織和石蠟組織的擴增效率均較差，但短擴增子可達到最佳擴增效率。參數(shù)R2表示擴增效率的可重復性，本研究短擴增子的R2明顯高于長擴增子。進一步證實短擴增子的擴增效率穩(wěn)定。

通常認為，冰凍組織中LncRNA比石蠟組織保存更好。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短擴增子在冰凍組織、石蠟組織中Ct比較并無統(tǒng)計學差異。表明使用短擴增子在石蠟組織中對LncRNA定量分析是有效的。進一步分析發(fā)現(xiàn)，短擴增子和長擴增子在冰凍組織中的定量一致性為62.5%，而冰凍組織和石蠟組織短擴增子的定量一致性僅為25.0%。表明用單個短擴增子進行定量分析結(jié)果并不可靠。為此，我們選擇了3個短擴增子對石蠟組織的LncRNA進行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4條LncRNA中至少2個短擴增子Ct變化趨勢一致率達到100%。證實使用3個非重疊的短擴增子在石蠟組織中進行LncRNA定量分析是可行的。

綜上所述，篩選的4條LncRNA在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織中表達升高；在標準化保存的石蠟組織中，使用短擴增子對LncRNA進行定量分析是可行的。但LncRNA在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的具體作用機制仍需進一步研究。

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