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      細胞粘附分子CHL1缺失對炎癥性腸病的影響*

      2018-05-15 03:51:32王曉萌朱玲玲吳奎武
      中國應用生理學雜志 2018年1期
      關(guān)鍵詞:腸病炎癥性紅細胞

      王曉萌,趙 彤,成 祥,郭 寧,朱玲玲,施 明,吳奎武△

      (1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院認知與腦科學研究所,北京100850;2.徐州醫(yī)科大學腫瘤生物治療研究所,江蘇徐州221004)

      炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病,是一種胃腸道的炎癥性疾病,伴隨著嚴重的病理學變化,預后不佳,病因未明[1]。IBD在歐美國家高發(fā),在亞洲和南美洲,IBD的患病率也日益增高[2,3]。IBD的病因主要與環(huán)境、免疫、遺傳等因素有關(guān),反復發(fā)作的機制尚不清楚。部分觀點認為,腸道慢性炎癥的發(fā)生與腸道粘膜免疫缺陷有關(guān)[4,5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),細胞黏附分子在腸道炎癥發(fā)展的過程中起重要作用[5,6]。CHL1是一種在人體內(nèi)普遍表達的神經(jīng)細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM),在以往的研究中,發(fā)現(xiàn)它對成人神經(jīng)回路軸突形成、神經(jīng)元的生長和存活有著至關(guān)重要的作用[7,8]。另一方面,CHL1與結(jié)直腸癌刪除分子(deleted in colorectal carcinoma,DCC)有相似的結(jié)構(gòu)域。有研究表明,CHL1在結(jié)腸癌病人的結(jié)腸組織中表達降低[9,10]。但CHL1與炎癥性腸病之間的關(guān)系尚缺乏探討。本研究利用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導小鼠結(jié)腸炎模型,探討CHL1缺失對DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎癥的影響,以揭示CHL1在炎癥性腸病的發(fā)生中的作用。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 動物 C57BL/6小鼠,雄性,16~20 g,購自軍事科學院醫(yī)學研究院動物中心;C57BL/6背景的CHL1(-/-)小鼠,雄性,16~20 g,繁殖于軍事醫(yī)學科學院動物中心。

      1.1.2 試劑和儀器 DSS(MP Biochemical,US);其他常用化學試劑和實驗器材均購自軍事科學院醫(yī)學研究院試劑庫及條件處。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 動物實驗 C57BL/6遺傳背景的 CHL1(+/+)和 CHL1(-/-)小鼠飼養(yǎng)于軍事科學院醫(yī)學研究院SPF動物室,恒溫23℃~26℃,恒濕40%~60%,保持每日 12 h(8:00~20:00)光照時間。使用普通生長飼料和三蒸水飼養(yǎng),自由飲水飲食,每日加食,換水。每次實驗前,隨機區(qū)組設(shè)計法分組,參照體重值將小鼠分為數(shù)個體重相近的區(qū)組,之后按照隨機數(shù)表,分為對照組,DSS模型組,CHL1缺失組,CHL1缺失DSS模型組(n=5)。

      1.2.2 CHL1(-/-)小鼠炎癥性腸病模型的建立 將10只C57/BL6為遺傳背景的 CHL1(+/+)型小鼠按照隨機原則分為數(shù)量相等的對照組和DSS模型組(n=5);將 10只 C57/BL6為背景的 CHL(-/-)型小鼠按照隨機原則分為數(shù)量相等的CHL1缺失組和CHL1缺失DSS模型組(n=5);采用 DSS飼養(yǎng)小鼠誘導炎癥性腸病模型;DSS模型組和CHL1缺失DSS模型組自主飲用7 d含1.5%DSS蒸餾水,隨后改為蒸餾水飼喂2 d;對照組和CHL1缺失組飲用9 d蒸餾水,9 d后處死小鼠。

      1.2.3 糞便隱血評分 用200μl槍尖隨機挑取糞便至載玻片,用50μl PBS稀釋,蓋上載玻片,于高倍鏡下觀察紅細胞個數(shù)。糞便隱血的評分由多名專業(yè)人員采取雙盲法進行評分頂級,隱血評分根據(jù)紅細胞的個數(shù)分為6個等級:(1)無隱血:鏡下沒有紅細胞;(2)懷疑隱血:1~9個;(3)有隱血:10~30個;(4)輕度隱血;鏡下紅細胞大于30個;(5)中度隱血:鏡下紅細胞占2/3個視野;(6)重度隱血:鏡下紅細胞占全視野。

      1.3 統(tǒng)計學處理

      采用SAS 9.1進行統(tǒng)計學分析,計量資料均用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間方差齊采用方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni法;生存資料采用Log-Rank生存分析;計數(shù)資料采用Kruskal-wallis秩和檢驗。

      2 結(jié)果

      2.1 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠體重的影響

      與對照組相比,DSS模型組小鼠炎癥性腸病的表現(xiàn)并不強烈,只是出現(xiàn)了一定程度體重減輕,但是CHL1缺失DSS模型組小鼠從刺激的第7天開始,體重明顯減輕(P<0.01,表1)。

      Tab.1 Comparison of body weight,the percent of weight change among different groups(±s,n=5)

      Tab.1 Comparison of body weight,the percent of weight change among different groups(±s,n=5)

      A:CHL1(+/+);B:DSS-induced CHL1(+/+);C:CHL1(-/-);D:DSS-induced CHL1(-/-)**P<0.01 vs A group

      Time Body weight(g )A B C D A Percent of weight change(%)B C D Day 1 17.80±0.91 18.05±0.88 20.02±3.06 18.71±1.57 0±0 0±0 0±0 0±0 Day 3 18.94±1.04 19.03±1.81 21.97±2.40 20.45±1.9 6.35±0.89 5.30±6.32 10.40±6.36 9.21±1.28 Day 5 18.67±0.68 18.87±1.12 21.30±2.22 17.85±1.77 4.91±1.64 4.52±1.62 7.08±6.23-4.71±2.67 Day 7 19.06±0.25 18.34±1.19 21.98±1.97 14.80±1.86**7.24±4.25 1.55±1.89 10.77±8.71-21.08±4.70**Day 9 19.91±0.74 18.19±2.11 22.10±1.54 11.49±2.09**11.88±1.96 0.54±7.41**11.66±10.59-37.30±8.06**

      2.2 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠死亡率的影響

      隨著炎癥性腸病的發(fā)展,以C57/BL6為背景的DSS模型組小鼠并未出現(xiàn)死亡。但是,CHL1缺失模型組小鼠小鼠從第7天開始死亡,至DSS誘導的第9天死亡率高達80%,進行生存分析后顯示,Log-Rank值為 15.42(P<0.01)。

      2.3 CHL1缺失加重DSS誘導的炎癥性腸病模型小鼠便血

      以C57/BL6為背景的DSS模型組,炎癥性腸病的表現(xiàn)并不明顯,僅出現(xiàn)一定程度的糞便隱血(P<0.01)。與DSS模型組相比,CHL1缺失 DSS模型組小鼠,糞便隱血增多,從刺激的第7天開始,出現(xiàn)了明顯的便血,便血評分明顯升高(P<0.01,表2)。

      Tab.2 Comparison of fecal blood score and colon length among different groups

      2.4 CHL1缺失對DSS誘導的炎癥性腸組織的影響

      小鼠結(jié)腸測量長度分析顯示:CHL1缺失DSS模型組小鼠,與DSS模型組對比,其結(jié)腸組織明顯縮短(P<0.01,圖 1,表 2),這些現(xiàn)象都提示了 CHL1缺失加重了DSS誘導的炎癥性腸病。

      Fig.1 Changes of colon length after CHL1 deficiency on DSS-induced colitis

      3 討論

      CHL1屬于神經(jīng)細胞黏附分子L1家族成員,是由CHL1基因(又名 L1CAM2)編碼。2002年,CHL1基因敲除小鼠構(gòu)建成功。這大大促進了對CHL1體內(nèi)功能的研究。已有研究表明,CHL1在神經(jīng)細胞的生存、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。例如,在創(chuàng)傷修復過程中,CHL1參與神經(jīng)突觸形成、神經(jīng)突觸發(fā)生、神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)再生等過程[11]。在CHL1基因敲除小鼠中可觀察到大腦皮質(zhì)、嗅球和海馬部位的形態(tài)改變和神經(jīng)突觸功能異常[12]。本實驗室的前期工作中發(fā)現(xiàn),敲除CHL1可抑制神經(jīng)干細胞的增殖和分化[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn),CHL1還參與除神經(jīng)系統(tǒng)以外的病理生理過程。例如,有研究報道CHL1在多種腫瘤中表達降低,是潛在的抑癌分子[14]。但截至目前為止,還沒有CHL1參與炎癥調(diào)控的相關(guān)報道。本研究應用DSS誘導的小鼠炎癥性腸病模型發(fā)現(xiàn),CHL1缺失可顯著加重炎癥性腸病的進展。這可能對于發(fā)現(xiàn)CHL1的新功能具有重要意義。

      中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腸道聯(lián)系起來的神經(jīng)、內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)成為“腦-腸軸”。腦-腸通訊把中樞神經(jīng)信號,腸神經(jīng)系統(tǒng)及包括免疫反應在內(nèi)的腸功能有機聯(lián)系在一起。參與腦-腸對話的任一環(huán)節(jié)功能異常均就有可能影響腸道的炎癥反應[15]。慢性心理應激誘發(fā)的腎上腺素能神經(jīng)信號可加速DSS誘導的小鼠炎癥性腸病進程,伴隨著炎癥因子 IL-1β、IL-6及TNF-α的升高,以及 NF-κB信號通路的激活[16-18]。這些結(jié)果提示,神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)信號參與了炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展。見于CHL1在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要工作,本研究的發(fā)現(xiàn)可能為闡明“腦-腸軸”或神經(jīng)信號調(diào)控腸道炎癥反應的機制提供了重要線索。

      但是,由于本研究應用的 CHL1動物模型為CHL1基因全身敲除小鼠,目前還不能準確解析CHL1參與炎癥性腸病進程的精確機制。后續(xù)的研究需要應用CHL1基因組織特異性敲除的小鼠進行深入研究。

      【參考文獻】

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