模擬100 m氦氮氧常規(guī)潛水對家兔氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響*

李洋洋，石 路，張延猛，肖嬋娟，劉洪濤

（1.上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)研究院有限公司，2.上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)研究院，3.上海交通大學(xué)-千葉大學(xué)國際合作研究中心，上海200231）

潛水時，隨著周圍壓力的增加，氧分壓和氮分壓都會隨之增加。一旦超過氮分壓的耐受限度（一般為4.8～5.6 ATA）人就會出現(xiàn)視聽覺延遲、即刻記憶受損等“氮麻醉”現(xiàn)象；而超過氧的耐受限度（一般為3 ATA）則會出現(xiàn)急性氧中毒、氧驚厥等癥狀?？梢娍諝鈱τ诖笊疃鹊陌踩珴撍⒎抢硐霘怏w［1］。我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定空氣潛水的深度限定在60 m。氦氧潛水（heliox diving）雖然可以下潛的比較深，但“氦語音”和高壓神經(jīng)綜合征（high pressure nervous syndrome，HPNS）是其主要缺點［2］。

氦氮氧三元氣（Trimix）潛水是國外發(fā)展的潛水新技術(shù)，可以彌補空氣潛水的不足：氦氣的麻醉作用比氮小，呼吸阻力也小，故能提高機體對高壓的耐受限度，可以根據(jù)下潛深度和機體耐受范圍靈活調(diào)整氮、氧分壓，從而在克服空氣潛水“氮麻醉”和“氧中毒”的同時下潛的更深［3，4］。Rostain等系統(tǒng)地概括了動物對高氣壓的不同生理效應(yīng)，隨著壓力的升高，配制不同濃度的Trimix可以預(yù)防不同程度的HPNS的發(fā)生［5］。Bennett等亦證實在氦氧混合氣中加入適量的氮氣可以使人對高氣壓耐受限度可安全延伸至6.96 Mpa［6］。我國目前還沒有大深度 Trimix常規(guī)潛水技術(shù)的相關(guān)系統(tǒng)性研究。因此，明確Trimix常規(guī)潛水對機體生理、生化功能可能的影響和機制就十分迫切。本實驗旨在通過模擬家兔100 m Trimix常規(guī)潛水，探討100 m Trimix潛水對家兔血清氧化／抗氧化指標(biāo)、組織炎性因子和濕干比的影響，為今后開展人體實潛提供理論依據(jù)和科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性家兔16只，體重2～3 kg。將動物隨機分為兩組（n＝8）：空白組不進行模擬潛水；模擬潛水組按實驗設(shè)計的加減壓方案進行模擬潛水。

1.2 實驗設(shè)備及模擬潛水方案

高、低壓兩用動物艙，艙容0.3 m3，模擬高氣壓最大為6 MPa。模擬家兔100 m Trimix潛水加減壓方案：下潛速度為10 m／min，50 m以上家兔呼吸空氣，50 m以下往艙內(nèi)補入氦氣使呼吸氣成為Trimix，加壓到 100 m時艙內(nèi)氣體為 Trimix 14.5／41.8（14.5%氧，41.8%氦，43.6%氮），在 100 m停留 30 min。減壓上升速度為6 m／min，減壓至45 m時將艙內(nèi)Trimix置換為空氣；減壓至20 m時將艙內(nèi)空氣置換為富氧氣體（enriched air nitrox，EAN）（50%氧-50%氮）；減壓至6 m時將艙內(nèi)EAN置換為純氧（≥95%）。高壓暴露期間持續(xù)通風(fēng)，并于艙底放置鈉石灰以吸收家兔呼出的的CO2，暴露過程中艙內(nèi)溫度保持在 22℃～28℃。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 血清氧化／抗氧化指標(biāo) 潛水前采集家兔動脈血2 ml，家兔安靜30 min后進艙模擬潛水，模擬潛水減壓結(jié)束出艙后即可再采集家兔動脈血2 ml。常溫下離心（4 000 r／min，15 min）分離血清，-20℃保存，Elisa法分析檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondiadehyde，MDA）和過氧化脂質(zhì)（lipid peroxide，LPO）的表達水平。

1.3.2 組織炎性因子 分別取空白組和模擬潛水組家兔肺、腦組織，對炎性因子γ干擾素（interferongamma，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白介素 6（interleukin-6，IL-6）、白介素 8（interleukin-8，IL-8）、髓過氧化物酶活力（myeloperoxidase，MPO）和基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達進行Elisa測試。

1.3.3 組織濕干比 分別取空白組和模擬潛水組家兔肺、腦組織，在冰生理鹽水中漂洗去組織表面殘血，用濾紙吸干組織表面，稱濕重；放置80℃烤箱內(nèi)連續(xù)烘烤72 h，稱干重，計算組織濕干比。

Elisa試劑盒均購自安迪生物科技（上海）有限公司，嚴(yán)格按照Elisa說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析處理，測定值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。炎性因子和組織濕干比兩組均數(shù)比較采用獨立樣本 t檢驗，氧化／抗氧化指標(biāo)兩組均數(shù)比較采用配對 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

模擬100 m Trimix常規(guī)潛水后，家兔血清SOD和 GSH活性較潛水前明顯降低（P＜0.01），CAT、MDA和LPO含量則較潛水前顯著升高（P＜0.01，表 1）。

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

Tab.1 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on oxidative stress in rabbits（±s，n＝8）

SOD：Superoxide dismutase；CAT：Catalase；GSH：Glutathione；MDA：Malondiadehyde；LPO：Lipid peroxide**P＜0.01 vs pre-diving group

Group SOD（U／L）CAT（U／L）GSH（ng／L）MDA（nmol／L） ）Pre-diving 105.28±2.95 0.68±0.02 357.05±9.59 16.43±0.88 3.75±0.25 Post-diving 92.62±5.22** 0.76±0.05** 312.17±9.24** 20.25±0.69** 4.84±0.25 LPO（μmol／L**

2.2 炎性反應(yīng)指標(biāo)的變化

模擬潛水后家兔肺組織中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均較空白組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；模擬潛水后家兔肺組織濕干比較空白組均無顯著變化（表 2）。模擬潛水后家兔腦組織中 IL-8、IL-6、IFN-γ、TNF-α、MMP-9及MPO含量、活性均較空白組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；模擬潛水后家兔腦組織濕干比較空白組均無顯著變化（表3）。

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

Tab.2 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits brain tissue（±s，n＝8）

IFN-γ：Interferon-gamma；TNF-α：Tumor necrosis factor-α；IL-6：Interleukin-6；IL-8：Interleukin-8；MPO：Myeloperoxidase；MMP-9：Matrix metalloproteinase-9*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 873.72±27.32 179.85±4.98 61.64±1.95 42.56±2.66 90.03±2.73 44.27±2.19 5.82±0.42 Diving 937.49±14.16**197.32±6.56**67.35±3.13**45.60±1.34*98.71±2.32**50.39±1.60**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）5.83±0.44

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

Tab.3 Effects of simulated 100 m Trimix conventional diving on inflammatory reaction in rabbits lung tissue（±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs intact group

Group IFN-γ（ng／L）Wet／Dry ratio Intact 840.22±28.27 172.58±8.44 58.84±2.53 41.25±1.83 81.17±3.56 41.25±1.43 4.98±0.19 Diving 905.46±28.56**189.79±6.24**65.07±3.36**43.87±1.90*94.09±3.10**46.84±2.04**TNF-α（ng／L）IL-6（ng／L）IL-8（ng／L）MPO（U／L）MMP-9（μg／L）4.83±0.24

3 討論

本實驗根據(jù)Haldane減壓理論計算所得的水下階段減壓表進行了模擬家兔100 m Trimix常規(guī)潛水［7］。通過比較潛水前、后家兔血清氧化／抗氧化指標(biāo)、肺及腦組織炎性因子和濕干比的變化，明確100 m Trimix常規(guī)潛水對機體氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響，國內(nèi)尚屬首次。為我國今后大深度Trimix人體實潛提供了第一手資料，具有重要的指導(dǎo)意義。

機體在潛水或高氣壓時處于應(yīng)激狀態(tài)［8］。本實驗中，家兔潛水時的氧化應(yīng)激主要來自呼吸氣高氧分壓，家兔在100 m停留階段承受8倍常氧分壓（1.6 ATA）的壓力。Bitterman等［9，10］在人體及大鼠的實驗中均證實，單純高壓氧（280 kPa，90 min）暴露即可引起淋巴細(xì)胞亞型的改變，CD4+／CD8+比值在暴露后明顯降低。機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，產(chǎn)生大量氧自由基，抗氧化物質(zhì)損耗加快，可引起炎性因子的改變［11，12］。

本研究結(jié)果表明，家兔潛水后血清氧化／抗氧化指標(biāo)發(fā)生顯著改變，主要表現(xiàn)為SOD及GSH活力下降，MAD和LPO含量增加，說明潛水時的氧化應(yīng)激導(dǎo)致家兔抗氧化能力降低，自由基產(chǎn)生增多。CAT活性增強可能是過高的自由基或過氧化物濃度刺激導(dǎo)致的代償性改變，CAT活性升高不僅可以清除H2O2和其它過氧化物，其對自由基產(chǎn)生的多種途徑也有一定的抑制作用。模擬100 m Trimix常規(guī)潛水減壓后家兔肺、腦組織炎性因子 IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8水平均較空白組顯著升高，其可能機制是氧化應(yīng)激激活了轉(zhuǎn)錄因子如核因子NF-κ和激活蛋白，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)多種炎性反應(yīng)介質(zhì)如IL-8和TNF-α等的釋放。另一方面，募集在肺、腦組織的多種炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞又可釋放H2O2，等，加重氧化應(yīng)激。從而形成氧化應(yīng)激-炎性反應(yīng)-氧化物質(zhì)增多-氧化應(yīng)激加重一系列鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)。家兔在模擬100 m Trimix常規(guī)潛水后肺、腦組織MPO和MMP-9較空白組顯著升高，可能的機制是高壓／高氧分壓導(dǎo)致的氧化應(yīng)激使得機體MPO活性增加、MMPs系統(tǒng)激活，而MPO活性的增加又通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1和激活基質(zhì)金屬蛋白酶原-2使機體產(chǎn)生更多的MMP-9，從而形成正反饋。潛水組家兔組織濕干比較空白組未見顯著改變，提示潛水后兔肺間質(zhì)及肺泡血管通透性良好，血腦屏障及腦微循環(huán)正常，機體未發(fā)生因潛水引起的肺、腦水腫，說明組織炎性因子表達升高但并未產(chǎn)生病理性炎癥反應(yīng)。

綜上，模擬100 m Trimix常規(guī)潛水時的高氧分壓使家兔處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，氧化應(yīng)激改變了機體原有的氧化-抗氧化平衡，氧化和還原產(chǎn)物的改變進而激活促進了機體的炎性反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子釋放增多，反過來繼續(xù)加重氧化應(yīng)激，形成氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)相互作用、共同參與的防御機制。本實驗結(jié)果提示按照Haldane減壓理論建立的模擬兔100 m Trimix常規(guī)潛水暴露方案是可行的，但應(yīng)用到人體實驗和實際作業(yè)時仍需進一步深化研究和驗證。

【參考文獻】

［1］ Schwerzmann M，Seiler C.Recreational scuba diving，patent foramen ovale and their associated risks［J］.Swiss Med Wkly，2001，131（25-26）：365-374.

［2］ Boussuges A.A rat model to study decompression sickness after a trimix dive［J］.J Appl Physiol，2007，102（4）：1301-1302.

［3］ Levett DZH，Millar IL.Bubble trouble：a review of diving physiology and disease［J］.Postgrad Med J，2008，84（997）：571-578.

［4］ Arieli R，Ertracht O，Oster I，et al.Effects of nitrogen and helium on CNSoxygen toxicity in the rat［J］.JAppl Physiol，2005，98（1）：144-150.

［5］ Rostain JC，Dumas JC，Gardette B，et al.Effects of addition of nitrogen during rapid compression of baboons［J］.J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol，1984，57（2）：332-340.

［6］ Bennett PB，Coggin R，Roby J.Control of HPNSin humans during rapid compression with trimix to 650 m（2131 ft）［J］.Undersea Biomed Res，1981，8（2）：85-100.

［7］ 李洋洋，石 路，張延猛，等.模擬100 m氦氮氧常規(guī)潛水水下階段減壓方案的計算與動物實驗驗證［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2015，31（3）：197-200.

［8］ 李 慈，何 佳，劉民航，等.模擬65 msw氦氧飽和潛水對人體氧化應(yīng)激的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011（2）：250-252.

［9］ Bitterman N，Bitterman H，Kinarty A，et al.Effect of a single exposure to hyperbaric oxygen on blood mononuclear cells in human subjects［J］.Undersea Hyperb Med，1993，20（3）：197-204.

［10］Bitterman N，Lahat N，Rosenwald T，et al.Effect of hyperbaric oxygen on tissue distribution of mononuclear cell subsets in the rat［J］.J Appl Physiol，1994，77（5）：2355-2359.

［11］ Allan IM，Lunec J，Salmon M，et al.Reactive oxygen species selectively deplete normal Tlymphocytes via a hydroxyl radical dependent mechanism［J］.Scand J Immunol，1987，26（1）：47-53.

［12］ Bose KS，Vyas P，Singh M.Plasma non-enzymatic antioxidants-vitamin C，E，beta-carotenes，reduced glutathione levels and total antioxidant activity in oral sub mucous fibrosis［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（4）：530-532.