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    豬圓環(huán)病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

    2018-05-14 11:14李曉菲陳婷孫愛榮黃艷葛曉杰徐婷王彩宏秦立廷
    國外畜牧學(xué)·豬與禽 2018年10期

    李曉菲 陳婷 孫愛榮 黃艷 葛曉杰 徐婷 王彩宏 秦立廷

    摘要:為了檢測豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)并對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量,試驗(yàn)根據(jù)PCV2基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,建立了一種特異性檢測PCV2的TaqMan熒光定量方法。結(jié)果表明:該方法特異性良好;在5.Oxl01~5.O×l09拷貝/u L模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;敏感性是常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PoLymerase Chain Reaction,PCR)方法的100倍:重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于1.5%。與常規(guī)PCR方法相比,該方法對臨床樣品的檢出率更高。該方法的建立為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及研究PCV2核酸載量與臨床致病性關(guān)系提供了快速、準(zhǔn)確的檢測依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:豬圓環(huán)病毒2型;熒光定量方法;臨床樣品

    中圖分類號:S852.65

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:1001-0769(2018)10-0030-03

    豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovlrus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬,是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒,也是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒。PCV具有三個(gè)血清型,即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是一種可以感染豬的常規(guī)病毒,對豬無致病性。PCV2于1998年首次報(bào)道,對豬具有致病性,臨床上主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、皮炎腎病綜合征、繁殖障礙以及呼吸道和腸道疾病。2016年10月美國報(bào)道出現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒血清型-PCV3,該病毒能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。

    目前,PCV2臨床樣品常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)、間接免疫熒光試驗(yàn)、病毒分離鑒定以及序列測定等。這些常規(guī)方法操作繁瑣、耗時(shí)長,并且在PCV2檢測時(shí)特異性和敏感性存在不足。熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上引入了熒光探針,使得檢測方法具有更高的特異性和敏感性,并且PCR結(jié)束后可以直接觀察結(jié)果,無須進(jìn)一步凝膠電泳。整個(gè)試驗(yàn)過程操作簡單,用時(shí)短,最快可以在2h內(nèi)得到檢測結(jié)果。

    本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測PCV2及其病毒載量的TaqMan熒光定量PCR方法,為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒定量及流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的工具。

    1 材料與方法

    CFX96熒光定量PCR儀和Tl00梯度PCR購自伯樂公司、分光光度計(jì)購自Thermo公司、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AxyGen公司、核酸提取試劑盒購自invitrogen公司、PCR酶購自全式金公司、Premix Ex Taq (Probe qPCR)購自寶生物公司。

    1.2引物探針設(shè)計(jì)與合成

    應(yīng)用MegAlign軟件對多個(gè)PCV2基因序列進(jìn)行比較分析,在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針。上游引物序列為:5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3,下游引物序列為:5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3。探針序列為:5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3,其中,探針5端標(biāo)記FAM,3端標(biāo)記MGB。

    1.3標(biāo)準(zhǔn)品制備

    通過常規(guī)PCR擴(kuò)增PCV2目的基因,然后將目的產(chǎn)物回收、純化后與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒,經(jīng)鑒定為陽性的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品。

    1.4反應(yīng)條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

    首先通過溫度梯度PCR確定引物的最適退火溫度,然后用矩陣法對探針和引物的用量進(jìn)行摸索與改進(jìn),獲得最適合的探針引物濃度配比,確定反應(yīng)體系。將1.3中制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋,稀釋后對5.0×101~5.0×109拷貝/u L濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.5特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)

    利用建立的熒光定量方法對豬瘟病毒(ClassicalSwine Fever Virus,CSFV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudoraloies Virus,PRV)、PCV3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus,PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible GastroenteritisVirus,TGEV)、豬輪狀病毒(Rotavirus,RV)和豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)等病毒的互補(bǔ)DNA(Complementary DNA,cDNA)或DNA進(jìn)行檢測驗(yàn)證該方法的特異性。將陽性DNA按10倍稀釋至最低濃度為6. 12×101拷貝/u L,進(jìn)行PCR反應(yīng),比較兩種檢測方法的敏感性。用5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行4次批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn),并且根據(jù)C+值計(jì)算變異系數(shù)。

    1.6臨床樣品檢測

    由本實(shí)驗(yàn)室收集可疑PCV2臨床樣品78份,分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測和常規(guī)PCR檢測,比較分析結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

    通過常規(guī)PCR擴(kuò)增PCV2目的基因(圖1),產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒,經(jīng)鑒定為陽性的質(zhì)粒即為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品。測定DNA濃度后,換算成拷貝數(shù)為5.0×109拷貝/u L,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2反應(yīng)條件優(yōu)化

    熒光定量PCR反應(yīng)體系共為25 uL,含12.5 uL2×Premix Ex Taq、10uL RNase-free water、0.5 uL探針(10 uM)、0.5U L上游引物(10 uM)、0.5 uL下游引物(10 uM)、1 uL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)條件為:95℃3 min; 94℃15 s,60℃35 s,40個(gè)循環(huán)。

    2.3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    取濃度為5.0×101~5.0×109拷貝/uL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增后獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖2和圖3可知,線性關(guān)系良好,標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功,可用于臨床樣品的檢測。

    2.4特異性試驗(yàn)

    用所建立的熒光定量PCR方法對CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV、RV、PPV和PCV3等病毒的cDNA或DNA的檢測結(jié)果均為陰性,說明該方法與這些病毒無交叉反應(yīng)(圖4),試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的特異性。

    2.5敏感性試驗(yàn)

    熒光定量PCR方法能檢出的最低模板濃度為5.0×101拷貝/uL(圖2),而常規(guī)PCR能檢出的最低模板濃度為6. 12×103拷貝/uL(圖5),試驗(yàn)結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR方法的敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍左右。

    2.6重復(fù)性試驗(yàn)

    用5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于1.5%(表1),表明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

    2.7臨床樣品檢測結(jié)果

    對本實(shí)驗(yàn)室收集的可疑PCV2臨床樣品78份,分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測和常規(guī)PCR檢測。檢測結(jié)果表明,熒光定量PCR方法陽性檢出率(60.3%)比常規(guī)PCR方法(48.7%)更高(表2)。說明所建立的熒光定量方法比常規(guī)方法具有更高的敏感性,更適用于PCV2的臨床檢測,尤其是感染早期病毒含量較低時(shí)。

    3 討論

    PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征和其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的原發(fā)性病原。雖然PCV2所導(dǎo)致的豬群發(fā)病率和死亡率不高,但PCV2主要侵害豬的免疫系統(tǒng),干擾和破壞豬對其他疫病免疫抗體的產(chǎn)生和維持,從而繼發(fā)其他疾病,多種疾病引起的混合感染使死亡率升高,從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,PCV2的危害性不能孤立而言,更主要是表現(xiàn)在與其他疾病的繼發(fā)混合感染。

    目前,PCV2的檢測以血清學(xué)檢測和病原學(xué)檢測為主。由于受到母源抗體的影響,血清學(xué)抗體檢測普遍呈陽性,臨床指導(dǎo)意義不大。因此病原學(xué)檢測對于PCV2的預(yù)防與控制尤為重要。由于PCV2臨床發(fā)病與亞臨床感染豬群中病毒含量存在明顯不同,PCR靈敏度較差,易造成漏檢,而熒光定量PCR方法可以對抗原含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量,敏感性高,特異性好,并且整個(gè)過程所需時(shí)間更短,因此在病原檢測領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。

    本研究根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)中PCV2基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,建立了一種快速檢測PCV2病毒載量的TaqMan熒光定量PCR方法。通過優(yōu)化,使該方法在5.0×101~5.0×109拷貝/uL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,敏感性是常規(guī)PCR方法的100倍。綜上所述,該方法的建立為PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及研究PCV2核酸載量與PCV2臨床致病性關(guān)系提供了快速、準(zhǔn)確的檢測依據(jù)。

    (參考文獻(xiàn):3篇,略)

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