解糖類(lèi)芽孢桿菌的鑒定及殺滅實(shí)驗(yàn)

肖琳 陳中

摘 要：通過(guò)對(duì)菌株鑒定及DNA序列分析，確定菌株為解糖類(lèi)芽胞桿菌。采用實(shí)際應(yīng)用中的高效消毒劑對(duì)其進(jìn)行殺滅實(shí)驗(yàn)。且采用不同濃度，不同作用時(shí)間及溫度對(duì)其進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，最后選擇濃度為500ppm復(fù)方過(guò)氧乙酸消毒劑對(duì)其進(jìn)行殺滅。

關(guān)鍵詞：DNA序列分析；過(guò)氧乙酸復(fù)方消毒劑；解糖類(lèi)芽胞桿菌

解糖類(lèi)芽胞桿菌為生產(chǎn)用純水中分離出來(lái)的菌株，且在生產(chǎn)用水中檢出率較高。此菌細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陰性，在膨大胞囊內(nèi)有橢圓形芽孢，氧化酶陽(yáng)性。經(jīng)DNA序列分析為解糖類(lèi)芽胞桿菌。為保證食品生產(chǎn)用水的質(zhì)量，首先對(duì)它的屬性進(jìn)行研究，進(jìn)而尋找能有效殺滅此菌的消毒劑和消毒條件。通過(guò)選擇過(guò)氧乙酸復(fù)方消毒劑在實(shí)驗(yàn)室對(duì)解糖類(lèi)芽胞桿菌進(jìn)行了懸液定量殺菌試驗(yàn)。

鑒定

（1）菌落特征：將細(xì)菌菌株接種在MC營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上35℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落，發(fā)現(xiàn)菌落蔓延擴(kuò)散，呈油脂稍透明狀，圓形，菌落淡黃色，表面干燥，無(wú)固定大小。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無(wú)可溶性色素。[1]

（2）革蘭氏染色：細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色有時(shí)陽(yáng)性，有時(shí)陰性，膨大胞囊內(nèi)有橢圓形芽孢。

（3）觸酶：陽(yáng)性。

（4）耐高溫：采用100℃熱水用煮沸法30分鐘以上才能將其殺死。

（5）DNA序列分析。

測(cè)序引物：1492R和27F

測(cè)序結(jié)果：

拉丁名：Paenibacillus glucanolyticus

中文名：解糖類(lèi)芽胞桿菌

殺滅方法

2. 菌懸液制備

取純的解糖類(lèi)芽胞桿菌菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18h-24h，再劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)18h-24h，挑取上述培養(yǎng)物中菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)18h-24h，取上述新鮮培養(yǎng)物用稀釋液稀釋?zhuān)粗频镁鷳乙骸?/p>

2. 消毒劑制備

消毒劑為復(fù)方過(guò)氧乙酸消毒劑，是以過(guò)氧乙酸為主要有效成分的消毒劑，含量為4.0%-5.2%（W/V）。最終配制的有效成分含量為500ppm。

2.3 中和劑

5g/L硫代硫酸鈉、3.0%吐溫-80和3g/L卵磷脂PBS。

2.4 中和劑選擇試驗(yàn)

試驗(yàn)菌為解糖類(lèi)芽胞桿菌，試驗(yàn)分組為：①消毒劑+菌液；②（消毒劑+菌液）+中和劑；③（消毒劑+中和劑）+菌液；④中和劑+菌液；⑤正常菌對(duì)照；⑥未接種菌的培養(yǎng)基對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果，以第6組不長(zhǎng)菌，第3、4、5組組間菌數(shù)差不超過(guò)10%，第1組不長(zhǎng)菌或長(zhǎng)菌量遠(yuǎn)低于第2組，第2組長(zhǎng)菌量超過(guò)100cfu/ml，其組間菌落數(shù)誤差率不超過(guò)15%，表明所用中和劑及其濃度適宜。[2]

2.5 懸液定量殺菌試驗(yàn)

試驗(yàn)時(shí)，將0.5ml菌懸液先與0.5ml的小牛血清混合，加入4ml消毒液混合，作用至預(yù)定時(shí)間，取0.5ml混合液，加入4.5ml中和劑中，混勻。中和作用10分鐘，取中和后的混合液1ml接種平皿，另取0.5ml加入4.5ml稀釋液，混勻，吸取1ml接種平皿，并傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂TSA并混勻。于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3次，計(jì)算殺滅率。

3 結(jié)果

3. 中和鑒定試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，所選中和劑可有效中和最高試驗(yàn)濃度的消毒劑對(duì)解糖類(lèi)芽胞桿菌的殘余作用（表一）

3. 殺菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)溫度在試驗(yàn)溫度20±1℃條件下，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)選擇殺滅芽胞桿菌最短作用時(shí)間15分鐘。并在最短作用時(shí)間的0.5倍及1.5同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)證明，最低濃度500ppm，在作用時(shí)間15分鐘后，對(duì)解糖類(lèi)芽胞桿菌的平均殺滅對(duì)數(shù)值>5.00。

4 實(shí)際應(yīng)用

4. 清洗

用熱的純水配制2%CIP-100溶液（堿性洗滌溶液），啟動(dòng)設(shè)備裝置循環(huán)程序，讓CIP-100溶液在設(shè)備和管道系統(tǒng)中循環(huán)不少于45分鐘，去除管道中的有機(jī)物質(zhì)或油類(lèi)物質(zhì)，排空CIP-100溶液，然后用熱的純水ICH2929沖洗設(shè)備和管道系統(tǒng)不少于10分鐘。用冷的純水配制1%CIP-200溶液（酸性洗滌溶液）在系統(tǒng)中循環(huán)不少于45分鐘，為去除管道中的水垢，再用熱的純水沖洗設(shè)備和管道系統(tǒng)不少于10分鐘，取水樣檢測(cè)pH值，直至沖水樣達(dá)到中性。此清洗步驟可幫助去除管中的生物膜。

4. 消毒

用冷的純水（室溫即可）配制伏泰消毒液，使用濃度為500ppm，啟動(dòng)設(shè)備裝置循環(huán)程序，讓伏泰消毒液在設(shè)備和管道系統(tǒng)中循環(huán)不少于30分鐘，排空伏泰消毒液，然后用熱的純水沖洗設(shè)備和管道系統(tǒng)裝置至少10分鐘，取沖洗水樣到化學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)pH。如果未達(dá)到中性，繼續(xù)沖洗直至沖洗水的pH值為中性。

5 后續(xù)跟進(jìn)

持續(xù)每周取水樣，進(jìn)行微生物檢測(cè)，連續(xù)六個(gè)月內(nèi)均未檢出解糖類(lèi)芽胞桿菌，證明此消毒方法的可行性。

6 討論

過(guò)氧乙酸具有殺菌作用時(shí)間短，使用濃度低的優(yōu)點(diǎn)，使用后分解快，無(wú)殘留，不會(huì)殘留有毒物質(zhì)，不污染環(huán)境。該消毒液對(duì)鋁有輕度腐蝕作用，對(duì)銅，不銹鋼基本無(wú)腐蝕作用。[3]

參考文獻(xiàn)：

[1]東秀珠，蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).科學(xué)出版社，2001.2：57-58.

[2]衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范[S].北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2002：15-28.

[3]劉曾寧，王光建.消毒劑生產(chǎn)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.9：46.