基于ITS及GPD序列分析對(duì)貴州紫花菌的分類鑒定

董芳 張傳博 吳石平

摘 要 明確貴州省紫花菌分類地位，對(duì)其人工馴化、加工及活性物質(zhì)開發(fā)利用提供理論支撐。在貴州4個(gè)具有代表性的紫花菌產(chǎn)地附近的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，收集紫花菌樣本進(jìn)行組織分離，利用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。通過分離純化獲得20株菌株，根據(jù)子實(shí)體形態(tài)特征，在貴州市場(chǎng)收集的紫花菌主要分為兩類，一類形態(tài)特征與鮮艷乳菇（Lactarius vividus）一致，另一類形態(tài)特征與紅汁乳菇（L. hatsudake ）一致?；贗TS和GPD基因序列的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示分離獲得的15株菌株與鮮艷乳菇（L. vividus）的遺傳距離為0，在系統(tǒng)發(fā)育樹上以較高的自舉支持率與鮮艷乳菇（L. vividus）聚為一支，將15株菌株鑒定為鮮艷乳菇（L. vividus）；5株菌株與紅汁乳菇（L. hatsudake）的遺傳距離為0，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與紅汁乳菇（L. hatsudake）聚為一支，自舉支持率為100%，將5株菌株鑒定為紅汁乳菇（L. hatsudake）。筆者在貴州市場(chǎng)上收集到的紫花菌中沒有鑒定出松乳菇（L. deliciosus），可能與近年松乳菇采集過度或因環(huán)境改變導(dǎo)致其發(fā)生量減少有關(guān)，也有可能是松乳菇與鮮艷乳菇、紅汁乳菇形態(tài)較為接近，不易區(qū)分導(dǎo)致錯(cuò)誤鑒定有關(guān)。

關(guān)鍵詞 紫花菌；鮮艷乳菇；紅汁乳菇；多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) Q939.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Tissue isolation of specimens collected from 4 representative zihuajun producing areas near the agricultural commodities market in Guizhou were used to identify the taxonomic status of Zihuajun by morphology and molecular phylogeny. Twenty strains were obtained by separation and purification. Zihuajun were mainly divided into two categories according to morphological characteristics of the sporophore. One of the morphological features was consistent with Lactarius vividus； and another kind of morphological characteristics was consistent with L. hatsudake. Based on the genetic distance and phylogenetic analysis of ITS and GPD gene sequences， it showed that the genetic distance between 15 strains and L. vividus was 0. On the phylogenetic tree， a higher bootstrap support rate with L. vividus were clustered into one branch， and the 15 strains were identified as L. vividus. The genetic distance between the other 5 strains and L. hatsudake was 0. On the phylogenetic tree， they were clustered together with L. hatsudake， and the bootstrap support rate was 100%， and the 5 strains were identified as L. hatsudake. No L. deliciosus among Zihuajun collected in Guizhou markets was identified. It may be related to the excessive collection of L. deliciosus in recent years or less due to environmental changes. It is also possible that L. deliciosus is closer to the morphology of L. vividus and L. hatsudake， and is not easy to distinguish， resulting in erroneous identification.

Keywords Zihuajun； Lactarius vividus； Lactarius hatsudake； multiple gene phylogenetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.017

紫花菌一般被認(rèn)為是松乳菇（Lactarius delicious （L.） Gray）的別稱[1-2]，或作為松乳菇（L. deliciosus）中紫銅色松乳菇的別名[3-5]，系紅菇科，乳菇屬，是我國西南地區(qū)常見野生食用菌之一，其脆嫩可口、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受當(dāng)?shù)厝嗣裣矏?；紫花菌還具有抑制腫瘤、抗菌消炎等作用[6]，是一種極具開發(fā)價(jià)值的食（藥）用菌。該菌也是貴州等地乳菇屬的主要野生菌。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州市場(chǎng)上出售的紫花菌與松乳菇形態(tài)特征有一定差異，準(zhǔn)確鑒定貴州野生紫花菌，對(duì)紫花菌的野生撫育、人工馴化、加工及活性物質(zhì)開發(fā)利用具有重要意義。李河等[7]利用ITS（internal transcribed spacer，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）序列將湖南省2類乳菇屬貿(mào)易種鑒定為松乳菇和半血紅乳菇（L. semisanguifluus）。Nuytinck等[8]曾用以ITS序列和GPD（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，甘油醛-3-磷酸脫氫酶）序列為基礎(chǔ)的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析方法對(duì)乳菇屬全球范圍內(nèi)的38個(gè)種進(jìn)行系統(tǒng)分類。楊祥開等[9]基于ITS序列對(duì)紅汁乳菇組織分離菌株進(jìn)行分子鑒定。Wang等[10]以鮮艷乳菇子實(shí)體為鑒定材料，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)進(jìn)行研究。趙輝等[11]利用ITS序列鑒定出組織分離菌株為鮮艷乳菇（L. vividus）。研究結(jié)果表明分子系統(tǒng)學(xué)結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對(duì)乳菇屬進(jìn)行分析，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)結(jié)合基于ITS和GPD等2個(gè)基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析方法對(duì)從貴州4個(gè)具有代表性的紫花菌產(chǎn)地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)收集的紫花菌分離獲得的20株菌株進(jìn)行鑒定，明確貴州省紫花菌的分類地位，從而為其人工馴化、加工及活性物質(zhì)開發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

分別于2016年7—11月從貴州安順、江口、開陽、花溪等具有代表性的紫花菌產(chǎn)地的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)收集紫花菌，根據(jù)形態(tài)特征，將收集到的紫花菌進(jìn)行歸類，每一類選取菌蓋完整、菌褶完好，沒有腐爛的新鮮子實(shí)體，進(jìn)行組織分離，子實(shí)體樣本信息見表1。主要試劑：2× Taq PCR MasterMix和基因組DNA提取試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司、引物由捷瑞（上海）生物工程有限公司合成，其他生化試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL、馬尾松土壤浸出液200 mL（馬尾松土壤20 g，蒸餾水200 mL，煮沸過濾），高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的獲得 參考食用菌組織分離法[12]，并做適當(dāng)修改。紫花菌子實(shí)體用75%的酒精進(jìn)行消毒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用手從菌蓋中間將子實(shí)體一分為二，用注射器的針頭分別在菌蓋內(nèi)側(cè)及菌蓋和菌柄交界處的斷面挑取3 mm×3 mm的組織塊，接種到上述培養(yǎng)基中。每個(gè)子實(shí)體接種4個(gè)組織塊，于26 ℃下避光培養(yǎng)7 d，注意每天觀察菌絲生長情況，及時(shí)將污染的雜菌剔除。當(dāng)菌落達(dá)到1 cm左右時(shí)可轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌絲DNA的提取 從供試菌落上收集菌絲，加液氮研磨成粉末狀后，用基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN DP305）提取菌絲基因組DNA。

1.2.3 引物選擇 ITS基因片段參照Michael等[13]設(shè)計(jì)的引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）引物。GPD基因片段采用Kreuzinger等[14]設(shè)計(jì)的引物CTK-132re（5′-GTCTACATGTTCAAG TACGACTC-3′）和CTK-133rev（5′-CCGATGAAG TCAGTTGACACTAC-3′）。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR反應(yīng)體系（30 μL）：2× Taq PCR MasterMix 15 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 13 μL。ITS擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。GPD擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性90 s，95 ℃變性45 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至北京賽諾基因有限公司測(cè)序。

1.2.5 遺傳距離分析 運(yùn)用MAFFT軟件對(duì)分離獲得菌株的ITS與GPD序列以及在GenBank中3種乳菇的ITS與GPD序列進(jìn)行對(duì)齊[15]。為實(shí)現(xiàn)排列對(duì)齊匹配的最優(yōu)化，采用手動(dòng)進(jìn)行校正，將對(duì)齊后的ITS和GPD基因序列連接成多基因序列。根據(jù)序列相似性將本次試驗(yàn)所測(cè)的20株菌株進(jìn)行分組，序列完全一致的歸為一組，每組選取1株菌株的多基因序列與GenBank中3種乳菇的多基因序列利用MEGA6軟件計(jì)算遺傳距離。

1.2.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫上對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行比對(duì)，初步確定紫花菌的分類地位。從GenBank中下載模式菌株或重要菌株的ITS和GPD基因參考序列（表2）；參照1.2.5節(jié)的方法將相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)齊，利用DAMBE（v5.3.70）對(duì)序列替換顛換飽和度進(jìn)行測(cè)定[16]，通過Gblocks（v0.91b.）提取保守的、比對(duì)結(jié)果好的區(qū)域，運(yùn)用Paup* 4.0 beta 10軟件以最大簡(jiǎn)約法（maximum parsimony，MP）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花菌形態(tài)特征觀察

貴州市場(chǎng)上收集到的紫花菌品種主要為兩類。第一類：子實(shí)體橙色，顏色鮮艷，菌蓋扁半球形，表面光滑，中央有凹陷，有同心環(huán)紋，菌蓋邊緣內(nèi)翻，厚而整齊。菌肉幼時(shí)橙黃色，傷后變淺綠色。菌褶與菌蓋同色，稍密，老后變綠色。菌柄近圓柱形，表面有藍(lán)綠斑，內(nèi)部中空，淺橙色，該類型紫花菌與鮮艷乳菇的形態(tài)一致（圖1-A）。第二類：子實(shí)體黃褐色，菌蓋扁半球形，表面有藍(lán)綠斑，中央臍凸，同心環(huán)紋不明顯，菌蓋邊緣幼時(shí)內(nèi)卷，后平展。菌肉幼時(shí)淡紫色，傷后變藍(lán)綠色。菌褶密，分叉，與菌蓋同色，傷后變藏綠色。菌柄圓柱形，中空，顏色較深于菌蓋，該類型紫花菌與紅汁乳菇（L. hatsudake）的形態(tài)一致（圖1-B）。

2.2 紫花菌的分離培養(yǎng)特性

對(duì)貴州安順、江口、開陽、花溪等具有代表性產(chǎn)地的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的紫花菌進(jìn)行組織分離并成功獲得20株菌株，部分分離菌株的菌絲培養(yǎng)特性見表3。從子實(shí)體的2個(gè)不同部位分離（菌蓋、菌蓋與菌柄交界處）取樣均能萌發(fā)生成菌絲，菌絲萌發(fā)時(shí)間在5～6 d，菌蓋相對(duì)菌蓋與菌柄交界處晚1 d，菌絲形態(tài)特征分為兩類，第一類：菌蓋橙色，其菌絲為橙黃色，呈放射狀平鋪；第二類：菌蓋黃褐色，其菌絲為白色至淡黃色，呈放射狀平鋪，有爬壁現(xiàn)象。

2.3 紫花菌與乳菇屬ITS和GPD遺傳距離 分析

測(cè)序結(jié)果表明，分離獲得的20株菌株根據(jù)序列相似性可分為以下5組，ZHJ07-2、ZHJ08-1、ZHJ08-2、ZHJ08-3、ZHJ09-1、ZHJ07-1、ZHJ09-4、ZHJ09-5、ZHJ09-6、ZHJ09-7、ZHJ10-2、ZHJ10-1共12個(gè)菌株為第一組，ZHJ09-9、ZHJ08-4和ZHJ11-1共3個(gè)菌株為第二組，ZHJ09-3和ZHJ10-3為第三組，ZHJ11-2和ZHJ09-8為第四組，ZHJ09-2為第五組，各組內(nèi)序列完全一致。

每組各選取1株菌株（ZHJ07-2、ZHJ08-4、ZHJ10-3、ZHJ09-2、ZHJ11-2）的多基因序列與GenBank中3種乳菇的多基因序列計(jì)算遺傳距離。從表4中可以看出，ZHJ07-2、ZHJ08-4與鮮艷乳菇菌株的遺傳距離為0，說明ZHJ07-2、ZHJ08-4與鮮艷乳菇菌株親緣關(guān)系非常近，ZHJ07-2、ZHJ08-4與紅汁乳菇、松乳菇菌株的遺傳距離分別為0.022、0.025，說明這2株菌株與紅汁乳菇、松乳菇菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ZHJ09-2、ZHJ10-3、ZHJ11-2與紅汁乳菇菌株的遺傳距離為0，說明這3株菌株與紅汁乳菇菌株的親緣關(guān)系較近，ZHJ09-2、ZHJ10-3、ZHJ11-2與松乳菇、鮮艷乳菇菌株的遺傳距離分別為0.015、0.022，說明這3株菌株與松乳菇、鮮艷乳菇菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。綜合上述分析，本次實(shí)驗(yàn)分離獲得的20株菌株，其中15株菌株與鮮艷乳菇親緣關(guān)系非常近；5株菌株與紅汁乳菇親緣較近。

2.4 紫花菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫上對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)收集到的紫花菌主要是松乳菇的近緣種，所以選取松乳菇等6個(gè)近緣種的基因序列作為參比序列，采用紅乳菇作為外群。分離獲得的20株菌株的ITS和GPD基因序列及13條參比菌株的ITS和GPD基因序列總長度為1 147 bp，其中一致的序列956 bp，無簡(jiǎn)約信息的可變堿基為100 bp，具有簡(jiǎn)約信息的堿基91 bp。以最簡(jiǎn)約法構(gòu)建多基因系統(tǒng)樹，共得到2棵最簡(jiǎn)約系統(tǒng)樹，經(jīng)Kishino- Hasegawa測(cè)試，系統(tǒng)樹之間沒有顯著差異，樹 長（TL）、一致性指數(shù)（CI）、保留指數(shù)（RI）和復(fù)定指數(shù)（RC）分別為：226、0.916、0.977和0.895。

對(duì)構(gòu)建的多基因系統(tǒng)樹進(jìn)一步分析（圖2），發(fā)現(xiàn)分離獲得的20株菌株聚在2個(gè)分支。其中，ZHJ09-2、ZHJ09-3、ZHJ09-8、ZHJ10-3和ZHJ11-2共5個(gè)菌株以100%的自舉支持率與紅汁乳菇聚為一支，然后與松乳菇和橙色乳菇（L. akahatsu）聚為姐妹支，自舉支持率為89%；分子系統(tǒng)學(xué)角度顯示ZHJ09-2、ZHJ09-3、ZHJ09-8、ZHJ10-3和ZHJ11-2共5個(gè)菌株為紅汁乳菇。另一類群的15個(gè)菌株全部與鮮艷乳菇聚為一支，自舉支持率為100%，并與松乳菇、橙色乳菇、鮭色乳菇（L. salmonicolor）、紅汁乳菇和血紅乳菇（L. sanguifluus）這5個(gè)近緣種構(gòu)成近緣種，揭示ZHJ07-1、ZHJ07-2、ZHJ08-1、ZHJ08-2、ZHJ08-3、ZHJ08-4、ZHJ09-1、ZHJ09-4、ZHJ09-5、ZHJ09-6、ZHJ09-7、ZHJ09-9、ZHJ10-1、ZHJ10-2和ZHJ11-1與鮮艷乳菇為同一種真菌。

3 討論

傳統(tǒng)的真菌分類主要依據(jù)形態(tài)特征。但是乳菇屬多個(gè)種形態(tài)特征十分相似，僅通過形態(tài)學(xué)特征的傳統(tǒng)方法很難將他們準(zhǔn)確區(qū)分[18]，如紅汁乳菇和血紅乳菇，乳汁都是血紅色，且子實(shí)體顏色和其他特征幾乎沒有區(qū)別。隨著核酸分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，ITS及GPD序列作為一種分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究和物種鑒定。桂明英等[19]基于ITS序列和形態(tài)學(xué)特征對(duì)新疆蘆葦根蘑菇進(jìn)行分類鑒定。張津京等[20]利用GPD基因序列分析斑玉蕈與其他真菌的親緣關(guān)系。目前，運(yùn)用分子生物學(xué)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定真菌更準(zhǔn)確可靠。

本研究依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)鮮艷乳菇、松乳菇和紅汁乳菇做了比較分析。鮮艷乳菇乳汁淺橙色，放置后不變色，子實(shí)體顏色鮮艷呈橙色，傷后變綠色，菌蓋表面具有明顯同心環(huán)紋，中部下凹，菌柄表面有藍(lán)綠斑。紅汁乳菇乳汁為血紅色，放置后變醬油色，子實(shí)體黃褐色，傷后變深青色，菌蓋表面同心環(huán)紋不明顯，中部呈臍狀，菌柄表面無窩斑。松乳菇乳汁橘紅色，放置后不變色，子實(shí)體胡蘿卜黃色，傷后變淺綠色，邊緣傷后變綠顯著，菌蓋表面具明顯同心環(huán)紋，中央臍狀，菌柄表面具暗橙色窩斑[6]。綜合上述分析，圖1-A與鮮艷乳菇一致，圖1-B與紅汁乳菇一致?；贗TS和GPD基因序列的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示分離獲得的15株菌株與鮮艷乳菇的遺傳距離為0，在系統(tǒng)發(fā)育樹上以較高的自舉支持率與鮮艷乳菇聚為一支；5株菌株與紅汁乳菇的遺傳距離為0，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與紅汁乳菇聚為一支，自舉支持率為100%。綜合上述分析，分離獲得的20株菌株中，15株為鮮艷乳菇，5株為紅汁乳菇。

李靜等[4]根據(jù)形態(tài)特征把貴州紫花菌定為紫銅色松乳菇，但是本研究基于形態(tài)學(xué)結(jié)合分子系統(tǒng)學(xué)對(duì)貴州紫花菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)貴州紫花菌主要為鮮艷乳菇，其次為紅汁乳菇，并未鑒定出松乳菇。因此認(rèn)為李靜等[4]將貴州紫花菌定為紫銅色松乳菇應(yīng)為誤定。筆者在貴州市場(chǎng)上收集到的紫花菌中沒有鑒定出松乳菇，可能與近年松乳菇采集過度或因環(huán)境改變導(dǎo)致其發(fā)生量減少有關(guān)。也有可能是松乳菇與鮮艷乳菇和紅汁乳菇形態(tài)較為接近，不易區(qū)分導(dǎo)致錯(cuò)誤鑒定有關(guān)。

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