真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響

劉生財(cái) 段俊朋 徐小萍 潘君飛 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 為探討真菌誘導(dǎo)子與龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的相關(guān)性，以龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞為材料，研究真菌誘導(dǎo)子種類、濃度及處理天數(shù)對(duì)龍眼愈傷組織細(xì)胞中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響。結(jié)果表明：在固體培養(yǎng)基中加入100 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌誘導(dǎo)子培養(yǎng)35 d時(shí)，最有利于類黃酮含量的積累，含量高達(dá)8.58 mg/g；擬莖點(diǎn)霉菌誘導(dǎo)子濃度為50 mg/L時(shí)培養(yǎng)35 d，最有利于類胡蘿卜素含量的積累，其含量為36.83 μg/g；膠孢鐮刀菌誘導(dǎo)子濃度為50 mg/L時(shí)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d，最有利于單寧含量的積累，其含量為10.50 mg/g。液體懸浮培養(yǎng)條件下，膠孢鐮刀菌誘導(dǎo)子濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，最有利于類黃酮含量的積累，其含量為6.29 mg/g；尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，最有利于類胡蘿卜素含量的積累，其含量為49.21 μg/g；膠孢鐮刀菌誘導(dǎo)子濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，最有利于單寧含量的積累，其含量為13.15 mg/g。本研究為將來(lái)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞工廠化生產(chǎn)類黃酮、類胡蘿卜素和單寧等次生代謝物質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 龍眼；胚性愈傷組織；真菌誘導(dǎo)子；類黃酮；類胡蘿卜素；單寧

中圖分類號(hào) S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To study the correlation between fungi elicitors and flavonoids， carotenoids and tannins in the embryogenic calli of longan， the embryogenic calli were used as the materials to investigate the effects of different kinds of fungi elicitors for the contents of flavonoids， carotenoids and tannin in callus cells. The results showed that under the condition of solid culture， the flavonoid content was the highest （8.58 mg/g） under the treatment of 100 mg/L Phomopsis longanae Chi for 35 d， and the carotenoid content was the highest （36.83 μg/g） under 50 mg/L P. longanae Chi treatment. For tannin， however， the content was the highest （10.50 mg/g） under Fusarium subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 35d. Under liquid culture， the flavonoid content was the highest （6.29 mg/g） under the treatment of 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d， the carotenoid content was the highest （49.21 μg/g） under the treatment of 200 mg/L F. Oxysporum for 7 d， and the tannin content was the highest （13.15 mg/g） under 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d. The above results could provide a scientific basis and technical support for studying the metabolic mechanism of flavonoids， carotenoids and alkaloids.

Keywords Dimocarpus longan Lour； embryogenic calli； fungal elicitors； flavonoids； carotenoids； tannins

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.015

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）屬于無(wú)患子科龍眼屬，是我國(guó)著名的熱帶亞熱帶特色水果之一，富含多種次生代謝產(chǎn)物，素有“南方人參”美譽(yù)，是國(guó)家衛(wèi)生部公布的法定的藥用和食用兩用的植物。龍眼中含有類黃酮、類胡蘿卜素、單寧等多種次生物質(zhì)[1-2]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用功能[3-4]。類黃酮是一大類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物功能，包括藥用價(jià)值和保健功能，類黃酮生物合成研究已經(jīng)成為植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標(biāo)[5]；類胡蘿卜素是目前國(guó)際上開(kāi)發(fā)和應(yīng)用最廣泛的天然色素之一，可作為食品、化妝品的著色劑被廣泛應(yīng)用，而且具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]，預(yù)防和減緩癌癥的發(fā)展[7]；單寧也是具有抗氧化、抗癌等藥用價(jià)值和保健功能[8]，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

根據(jù)植物細(xì)胞全能性理論，利用愈傷組織細(xì)胞可生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物。通過(guò)組培的方式能夠大大縮短生產(chǎn)周期，人為調(diào)控環(huán)境，不受季節(jié)等因素影響，實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，而且不會(huì)破壞生態(tài)資源。植物體中次生代謝產(chǎn)物的積累受到多種因素影響，誘導(dǎo)或者提高植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量具有重要的應(yīng)用前景。研究人員通過(guò)物理手段（如pH、溫度等）和化學(xué)因素（如激素、誘導(dǎo)子等）提高生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。尤其近幾年發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子能引起植物細(xì)胞生長(zhǎng)及影響細(xì)胞產(chǎn)生代謝物質(zhì)含量的積累[9]。真菌誘導(dǎo)子能使植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，并通過(guò)誘導(dǎo)植物積累特定的次生代謝產(chǎn)物來(lái)提高防御抗病能力[10]。在青錢柳（Cyclocarya paliurus）[11]、雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）[12]、南方紅豆杉（Taxus chinesis var. mairei）[13]、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）[14]等懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中添加真菌誘導(dǎo)子可大幅度提高細(xì)胞中的有效成分含量。在龍眼果肉中可分離獲得龍眼擬莖點(diǎn)霉、鐮刀菌和炭疽菌。添加一定的龍眼擬莖點(diǎn)霉、尖孢鐮刀菌和膠孢鐮刀菌，可影響龍眼胚性愈傷組織中影響多糖[15]和類黃酮含量[16]，但賀夢(mèng)真等[16]只是進(jìn)行了低濃度真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞中類黃酮含量影響，較高濃度的真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞中類黃酮含量影響效果還明確。因此，為探討真菌誘導(dǎo)子與龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的相關(guān)性，本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，研究真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響，為將來(lái)龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞工廠化生產(chǎn)類黃酮、類胡蘿卜素和單寧等次生代謝物質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為長(zhǎng)期保存的龍眼胚性愈傷組織，來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所[17]。

1.2 方法

1.2.1 真菌誘導(dǎo)子的制備 參照Wang等[18]的方法，制備膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點(diǎn)霉菌（菌種由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院贈(zèng)送）真菌誘導(dǎo)子。采用苯酚硫酸法[19]測(cè)定菌液中總糖含量的濃度（mg/L），根據(jù)真菌誘導(dǎo)子中的含糖量確定真菌誘導(dǎo)子的添加量。

1.2.2 真菌誘導(dǎo)子種類和濃度的篩選 將0.04 g龍眼胚性愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，pH為5.8，分別加入（膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點(diǎn)霉菌）3種真菌誘導(dǎo)子，每種真菌誘導(dǎo)子分別設(shè)置濃度分別為50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌誘導(dǎo)子為對(duì)照（Mock），然后放置于（25±2） ℃培養(yǎng)室進(jìn)行20 d暗培養(yǎng)。收取龍眼胚性愈傷組織，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復(fù)。

將2.0 g龍眼胚性愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇為基本培養(yǎng)基，pH 5.8，分別加入（膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點(diǎn)霉菌）3種真菌誘導(dǎo)子，每種真菌誘導(dǎo)子濃度分別設(shè)置為50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌誘導(dǎo)子為對(duì)照（Mock），然后放置于（25±2） ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min的搖床上，黑暗培養(yǎng)7 d時(shí)收取龍眼懸浮細(xì)胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復(fù)。

1.2.3 真菌誘導(dǎo)子處理時(shí)間的篩選 將0.04 g龍眼胚性愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基中，以MS+ 1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L為基本培養(yǎng)基，pH為5.8，添加本研究篩選得到最佳真菌誘導(dǎo)子種類和濃度，以不添加任何真菌誘導(dǎo)子為對(duì)照（Mock），放置于（25±2） ℃培養(yǎng)室進(jìn)行10、15、20、25、30、35 d暗培養(yǎng)，然后收取龍眼胚性愈傷組織，將樣品置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復(fù)。

將2.0 g龍眼胚性愈傷組織接種于液體培養(yǎng)基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+ 100 mg/L肌醇+7 g/L為基本培養(yǎng)基，pH為5.8，添加篩選得到最佳真菌誘導(dǎo)子種類和濃度，以不添加任何真菌誘導(dǎo)子為對(duì)照（Mock），放置于（25±2） ℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min的搖床上，黑暗培養(yǎng)1、3、5、7、9、11 d時(shí)收取龍眼懸浮細(xì)胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每種處理3次重復(fù)。

1.2.4 龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素及單寧含量測(cè)定 參考董慧雪等[20]的方法提取和測(cè)定龍眼胚性愈傷組織中類黃酮；參考張志軍等[21]的方法提取及測(cè)定樣品的類胡蘿卜素；參考鞠春艷等[22]的方法提取及測(cè)定樣品的單寧。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行相關(guān)分析、方差分析和顯著性測(cè)驗(yàn)，利用Excel 2010對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的影響

真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量有明顯影響。由表1可見(jiàn)，固體培養(yǎng)基中添加擬莖點(diǎn)霉菌可有效地提高龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量，而且隨著濃度升高呈先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)添加擬莖點(diǎn)霉菌濃度為100 mg/L時(shí)，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量達(dá)到了5.39 mg/g，是對(duì)照組的4.11倍，且差異極顯著（p<0.01）。而添加尖孢鐮刀菌和膠孢鐮刀菌時(shí)，對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量增加效果遠(yuǎn)不如添加擬莖點(diǎn)霉菌。因此，添加100 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮累積效果最好。

由表1可知，在液體懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，添加真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量影響與固體培養(yǎng)條件下差異非常大。添加擬莖點(diǎn)霉菌對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮累積有抑制作用，而且抑制效果達(dá)到極顯著水平；而添加一定濃度膠孢鐮刀菌可以促進(jìn)類黃酮累積。隨著膠孢鐮刀菌濃度增加，類黃酮含量呈“下降—上升—下降”趨勢(shì)，且在濃度為400 mg/L時(shí)，龍眼懸浮細(xì)胞中類黃酮含量最高，是對(duì)照組的1.28倍，達(dá)到了極顯著水平。

2.2 擬莖點(diǎn)霉菌處理時(shí)間對(duì)固體培養(yǎng)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的影響

根據(jù)真菌誘導(dǎo)子種類和濃度篩選結(jié)果，在固體培養(yǎng)基中加入100 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌，分析不同處理時(shí)間對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量的影響。由表2可見(jiàn)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量呈上升趨勢(shì)。在培養(yǎng)35 d時(shí)，培養(yǎng)基中添加擬莖點(diǎn)霉菌和對(duì)照培養(yǎng)基的龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量都達(dá)到最高，與其他處理時(shí)間相比達(dá)到極顯著水平，但擬莖點(diǎn)霉菌處理下類黃酮含量是8.58 mg/g，為對(duì)照的1.56倍。由此可知，添加100 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌培養(yǎng)35 d有利于類黃酮含量的積累。

2.3 膠孢鐮刀菌處理時(shí)間對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞中類黃酮含量的影響

根據(jù)真菌誘導(dǎo)子種類和濃度篩選結(jié)果，在液體培養(yǎng)基中加入400 mg/L膠孢鐮刀菌，比較不同處理時(shí)間對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞中類黃酮含量影響。由表3可見(jiàn)，龍眼懸浮細(xì)胞類黃酮含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在懸浮培養(yǎng)7 d時(shí)含量最高，為5.75 mg/g，極顯著高于其他處理時(shí)間，隨后類黃酮的含量逐漸減少。由此可得添加400 mg/L膠孢鐮刀菌懸浮培養(yǎng)7 d最有利于類黃酮含量的積累。

2.4 真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量的影響

真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量有明顯影響。由表4可見(jiàn)，在固體培養(yǎng)基上添加真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量積累幾乎都有抑制，而且隨著濃度增加抑制效果越明顯。只有添加50 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌真菌誘導(dǎo)子對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量有促進(jìn)作用，含量高達(dá)21.50 μg/g，是對(duì)照組的1.41倍。

液體懸浮培養(yǎng)條件下，真菌誘導(dǎo)子對(duì)類胡蘿卜素含量累積也是有抑制作用，但效果沒(méi)有固體培養(yǎng)條件下明顯。表4也可以看出，添加尖孢鐮刀菌濃度為200 mg/L對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞中類胡蘿卜素含量有促進(jìn)作用，與其他組相比達(dá)到極顯著水平，是對(duì)照組的1.16倍。且與固體培養(yǎng)相比，液體培養(yǎng)對(duì)促進(jìn)龍眼懸浮細(xì)胞中類胡蘿卜素含量累積的作用效果更明顯。

2.5 擬莖點(diǎn)霉菌處理天數(shù)對(duì)固體培養(yǎng)龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量的影響

在固體培養(yǎng)基中加入50 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌，分析不同處理天數(shù)對(duì)龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量的影響。由表5可見(jiàn)，處理天數(shù)越久，龍眼胚性愈傷組織類胡蘿卜素含量越高。在培養(yǎng)30 d前，對(duì)照中類胡蘿卜素含量高于添加50 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌的。但是，對(duì)照在培養(yǎng)20 d后，龍眼胚性愈傷組織中類胡蘿卜素含量增加比較緩慢，而添加50 mg/L擬莖點(diǎn)霉菌卻能夠保持快速增加，一直到培養(yǎng)結(jié)束，說(shuō)明擬莖點(diǎn)霉菌可能是在胚性愈傷組織培養(yǎng)的中后期對(duì)類胡蘿卜素含量累積有作用。

2.6 尖孢鐮刀菌處理天數(shù)對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞中類胡蘿卜素含量的影響

在液體培養(yǎng)基中加入200 mg/L尖孢鐮刀菌，分析不同處理天數(shù)對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞類胡蘿卜素含量的影響。由表6可見(jiàn)，龍眼懸浮細(xì)胞類胡蘿卜素含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，在懸浮培養(yǎng)7 d后，類胡蘿卜素的含量逐漸減少。由此可得添加200 mg/L尖孢鐮刀菌懸浮培養(yǎng)7 d最有利于類胡蘿卜素含量的積累。

2.7 真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)龍眼胚性愈傷組織中單寧含量的影響

真菌誘導(dǎo)子種類和濃度對(duì)固體培養(yǎng)龍眼胚性愈傷組織單寧含量有明顯影響。由表7可見(jiàn)，與對(duì)照相比，添加擬莖點(diǎn)霉菌和膠孢鐮刀菌均表現(xiàn)為隨著濃度的增加，龍眼胚性愈傷組織單寧含量先增高后降低的趨勢(shì)，而添加尖孢鐮刀菌隨著濃度的增加，龍眼胚性愈傷組織單寧含量逐漸降低。當(dāng)添加膠孢鐮刀菌濃度為50 mg/L時(shí)，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量最高，達(dá)到了6.42 mg/g，是對(duì)照組的1.46倍；濃度為500 mg/L時(shí)，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量明顯低于其他處理和對(duì)照。而在液體培養(yǎng)基中添加膠孢鐮刀菌濃度為400 mg/L對(duì)龍眼懸浮細(xì)胞中單寧含量有促進(jìn)作用，是對(duì)照組的1.32倍。

2.8 膠孢鐮刀菌處理天數(shù)對(duì)龍眼胚性愈傷組織單寧含量的影響

膠孢鐮刀菌對(duì)龍眼胚性愈傷組織中單寧含量有促進(jìn)作用。由表8可見(jiàn)，在固體培養(yǎng)基中加入50 mg/L膠孢鐮刀菌后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，龍眼胚性愈傷組織中單寧含量越高，而且高于對(duì)照，在培養(yǎng)35 d時(shí)單寧含量累積最多。

從表9可知，在液體培養(yǎng)基中加入400 mg/L膠孢鐮刀菌，龍眼懸浮細(xì)胞中單寧含量隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，先增高后降低，第7天的含量達(dá)到最高，為13.15 mg/g；而對(duì)照在第9天時(shí)含量才達(dá)到最高，為11.32 mg/g，說(shuō)明添加400 mg/L膠孢鐮刀菌懸浮培養(yǎng)可以促進(jìn)單寧在較短時(shí)間內(nèi)就可以積累。同時(shí)與固體培養(yǎng)條件相比，液體懸浮培養(yǎng)更有利于單寧累積。

3 討論

3.1 適宜的真菌誘導(dǎo)子類型和濃度有利于龍眼胚性愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累

真菌誘導(dǎo)子（fungal elicitor）主要是通過(guò)分離真菌菌絲體或發(fā)酵液制備而成的含有真菌及代謝物的滅菌溶液，能引起植物細(xì)胞生長(zhǎng)及影響細(xì)胞產(chǎn)生代謝物質(zhì)含量的積累[9]。不同的真菌誘導(dǎo)子及濃度對(duì)不同植物材料的作用效果也存在很大差別。200 mg/L黑曲霉誘導(dǎo)子處理青錢柳懸浮細(xì)胞3 d三萜含量為對(duì)照的10.79倍[11]；50 mg/L蘋果炭疽和柿子炭疽誘導(dǎo)子的加入不僅使不定根中雷公藤甲素的含量分別提高了2.24、1.93倍，生物堿的含量也分別提高了2.02、2.07倍[12]；60 mg/L尖孢鐮刀菌促進(jìn)南方紅豆杉紫杉醇的合成，與對(duì)照相比提高了5倍左右[13]；1 ml/L黑曲霉誘導(dǎo)子處理北柴胡毛狀根后的柴胡皂苷為對(duì)照的1.31倍[14]；80 mg/L炭角菌處理毛葡萄后黃酮和總酚分別為對(duì)照的1.76、1.65倍[23]。雖然在青錢柳、雷公藤、南方紅豆杉、柴胡、毛葡萄等懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中添加真菌誘導(dǎo)子可大幅度提高細(xì)胞中的有效成分含量，懷地黃組培苗中添加真菌誘導(dǎo)子可提高其次生代謝產(chǎn)物含量[24]，但不同植物使用的誘導(dǎo)子及濃度也不一致，可能是因?yàn)椴煌恼婢T導(dǎo)子參與了不同類型次生代謝產(chǎn)物代謝通路。對(duì)長(zhǎng)春花研究發(fā)現(xiàn)，致病性真菌可以強(qiáng)烈促進(jìn)長(zhǎng)春花合成生物堿，而非致病性真菌效果不明顯[25]。本文研究了膠孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬莖點(diǎn)霉菌不同濃度添加量對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素及單寧含量積累的影響，發(fā)現(xiàn)400 mg/L的膠胞鐮刀菌處理龍眼胚性愈傷組織后類黃酮和單寧的含量分別為對(duì)照的1.28、1.32倍，50 mg/L的擬莖點(diǎn)霉菌處理后類胡蘿卜素的含量為對(duì)照的1.41倍。該研究結(jié)果與賀夢(mèng)真[16]研究發(fā)現(xiàn)100 mg/L的擬莖點(diǎn)霉菌處理龍眼胚性愈傷組織后類黃酮含量最高不一致，可能是因?yàn)樘幚頋舛确秶蜁r(shí)間差異，本研究處理的濃度范圍更大，更有利于篩選出最佳處理濃度范圍。 因此，只有選擇適宜的真菌誘導(dǎo)子類型和濃度才有利于龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物含量累積。

3.2 真菌誘導(dǎo)子處理時(shí)間對(duì)龍眼胚性愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物積累的影響較大

除了真菌誘導(dǎo)子的種類和濃度之外，誘導(dǎo)處理的時(shí)間和培養(yǎng)方式也會(huì)對(duì)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生很大的影響。真菌誘導(dǎo)子處理白樺懸浮細(xì)胞1 d三萜含量就能達(dá)到最高[26]，黑曲霉誘導(dǎo)子處理青錢柳懸浮細(xì)胞3 d三萜含量和產(chǎn)量均達(dá)到最高[11]，在積雪草添加哈茨木霉菌的第10天積雪草苷含量比對(duì)照組增加了2.35倍[27]。不同日齡的長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)子的敏感性和反應(yīng)不同，培養(yǎng)20 d的長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞在綠色木霉誘導(dǎo)子作用下能顯著刺激阿瑪堿的產(chǎn)生[28]。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同真菌誘導(dǎo)子的處理時(shí)間對(duì)固體和液體培養(yǎng)的龍眼胚性愈傷次生代謝積累的差別較大，且液體懸浮培養(yǎng)比固體培養(yǎng)更能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量的次生代謝產(chǎn)物，而且產(chǎn)量也高于固體培養(yǎng)?？赡苁且?yàn)樵诠腆w培養(yǎng)條件下，龍眼胚性愈傷組織細(xì)胞沒(méi)有完全接觸到培養(yǎng)基，誘導(dǎo)子對(duì)其作用存在緩釋和間接作用，從而促使龍眼中次生代謝產(chǎn)物的累積需要更長(zhǎng)時(shí)間；而在懸浮培養(yǎng)中，因?yàn)榧?xì)胞完全接觸培養(yǎng)基，誘導(dǎo)子可以快速直接作用于細(xì)胞，從而影響了次生代謝產(chǎn)物累積，并且不同的培養(yǎng)方式所需要的真菌誘導(dǎo)子類型或者濃度也有所差別。真菌誘導(dǎo)子是如何參與植物次生代謝通路還需要進(jìn)一步研究。

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