一種富硒蛇莓的培育方法

茍?bào)w忠　賀仲兵　潘甚錫

摘要 [目的]探討一種富硒蛇莓的培育方法。[方法]采用亞硒酸鈉濃度0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL的水溶液對蛇莓葉噴施，考察噴施亞硒酸鈉后有機(jī)硒在蛇莓中的變化規(guī)律。[結(jié)果]葉面噴施硒能顯著提高蛇莓中的有機(jī)硒含量。蛇莓中有機(jī)硒的含量隨噴施亞硒酸鈉濃度的提高而增加，當(dāng)噴施亞硒酸鈉濃度達(dá)到256 ng/mL時(shí)，蛇莓中的有機(jī)硒含量達(dá)到最大值，其值為20.94 μg/g。[結(jié)論]蛇莓葉面噴施亞硒酸鈉溶液的最佳濃度為256 ng/mL，且采用低濃度的亞硒酸鈉溶液對蛇莓進(jìn)行多次噴硒的方法有利于蛇莓對無機(jī)硒的吸收和轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞 蛇莓；亞硒酸鈉；葉面噴施；硒

中圖分類號 S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0065-03

Abstract [Objective] To research a method of cultivating richselenium Duchesnea indica （Andr.） Focke. [Method]Sodium selenite was sprayed on the leaves of D. indica，the concentrations of which were 0， 2， 4， 8， 16， 32， 64， 128， 256， 512 ng/mL， respectively. The change law of organic selenium in D. indica after spraying sodium selenite was investigated. [Result] With the rise of spraying sodium selenite concentration， the content of organic selenium was significantly improved.When spraying sodium selenite concentration reached 256 ng/mL， the content of organic selenium in D. indica reached the maximum， which was 20.94 μg/g. [Conclusion] The optimum concentration of sodium selenite spraying on leaves of D. indica was 256 ng/mL. And the low concentration of inorganic selenium spraying on D. indica repeatedly was benefical for its absorption and transformtion.

Key words Duchesnea indica （Andr.） Focke；Na2SeO3；Forliar spraying；Selenium

蛇莓為薔薇科植物蛇莓（Duchesnea indica（Andr.）Focke）的全草，又名龍吐珠。性甘、苦、寒，有小毒。具有涼血消腫，清熱解毒，化痰止咳的功效。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，蛇莓具有抗癌細(xì)胞突變作用，其抗癌效果較強(qiáng)。目前，蛇莓與其他中草藥配伍可以治療食管癌、胃癌、肝癌、直腸癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、胸腺癌、皮膚癌等多種癌癥[1]。

硒不但是人體必需的微量元素之一，而且也是“抗癌之王”[2]。若抗癌中草藥中的有效成分與硒形成植物有機(jī)硒，該有機(jī)硒可能具有功效更加獨(dú)特的療效。因此，從富硒抗癌中草藥中提取有機(jī)硒并對其進(jìn)行抗癌活性研究，將會成為尋找抗癌新藥的有效途徑之一。目前，雖然有學(xué)者從天然植物中提取出了部分有機(jī)硒化合物，如：甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]、硒代蛋氨酸（Se-Met，NH2-CH（CO2H）-CH2-CH2-Se-CH3）[5]、硒代半光氨酸（Se-Cys，NH2-CH（CO2H）-CH2-SeH）[5]、丙基硒代半胱氨酸（ProSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH2-CH3）[5]、硒代光氨酸（Se-Cys2，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH（CO2H）NH2）[6]，其中甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]已被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗癌活性。但天然植物中有機(jī)硒的含量是有限的，很多有機(jī)硒化合物由于含量低而不能被檢測，因此從藥用植物中尋找抗癌有機(jī)硒化合物受到了限制。有學(xué)者研究表明，葉面噴硒能顯著提高植物體內(nèi)有機(jī)硒的含量[7-9]。鑒于此，筆者以具有抗癌活性的蛇莓作為研究對象，采用葉面噴施亞硒酸鈉的方法，探討葉面噴施亞硒酸鈉對蛇莓有機(jī)硒含量的影響，并篩選出富硒蛇莓的最佳亞硒酸鈉濃度，以便為下一步采用制備液相色譜法從富硒蛇莓中分離含硒有機(jī)物，以及將該有機(jī)硒化合物用于醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年6—12月在凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心的溫室內(nèi)進(jìn)行。供試土壤為黃壤，為了增加土壤的肥力和透氣性，將黃壤、兔子糞和細(xì)木碎屑按2.0∶1.0∶0.5拌勻，并將等量的上述土壤裝入30個(gè)大盆（直徑30 cm，高度20 cm）中待用。供試蛇莓種子和亞硒酸鈉分別由沭陽縣佳康園林綠化苗木場和上海晶純生化科技股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)處理共9個(gè)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以不噴硒為空白（CK）。自蛇莓幼苗長出5～6片葉時(shí)，對其葉片的正反面進(jìn)行均勻噴硒。10個(gè)處理（CK，T1～T9）對應(yīng)的亞硒酸鈉溶液濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL，每次噴施亞硒酸鈉溶液100 mL，間隔時(shí)間為10 d，共噴硒10次。

1.3 項(xiàng)目測定

1.3.1 樣品的前處理。

噴硒結(jié)束后的第10天采摘蛇莓樣品，先將其裝滿自來水的大桶中漂洗5次，再用蒸餾水漂洗3次，然后將其自然晾干并放入70 ℃烘箱中干燥至恒重。干燥后的蛇莓樣品用小型粉碎機(jī)（HK-02A，旭朗機(jī)械成都分公司）粉碎并過200目篩，儲存于自封袋中待用。

1.3.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配置（1 000 ng/mL）：準(zhǔn)確量取1 mL 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（BW079812，標(biāo)準(zhǔn)值：100 μg/g）于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻待用。

硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置：準(zhǔn)確量取0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL的硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6個(gè)100 mL的容量瓶中，加入25 mL 濃鹽酸，用超純水定容至刻度，即得0、2、4、8、16、32 ng/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，搖勻待測。

1.3.3 總硒的提取。

蛇莓中總硒的提取在凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院原子熒光分析室完成，并采用茍?bào)w忠等[10]建立的分析方法測定蛇莓樣品中的總硒。其簡要分析流程為：稱取約0.500 0 g樣品于150 mL錐形瓶中，加入15 mL 混酸（VHNO3∶VHClO4=2∶1），冷消化過夜，并于電熱板上加熱樣品溶液至1 mL，加入5 mL濃鹽酸，再加熱樣品溶液至1 mL，取下冷卻，用超純水將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并加入12.5 mL濃鹽酸，最后用超純水定容至刻度，搖勻待測。

1.3.4 無機(jī)硒的提取。

采用催海容等[11]建立的方法提取蛇莓中的無機(jī)硒。其簡要流程為：準(zhǔn)確稱取1.000 0 g蛇莓樣品，置于50 mL離心管中，分2次加入25 mL超純水，超聲提取30 min，5 000 r/min條件下離心10 min，2次提取的上清液合并，再用等量的環(huán)己烷萃取1次，棄去有機(jī)相，水相轉(zhuǎn)入150 mL錐形瓶中，然后按“1.3.3”操作。

1.3.5 硒含量的測定。

樣品中的硒含量采用順序注射雙道原子熒光光度計(jì)（AFS-230E，北京海光儀器有限公司）進(jìn)行測定。

1.3.6 總硒/無機(jī)硒含量的計(jì)算。

總硒/無機(jī)硒含量（ng/g）=溶液濃度（ng/mL）×溶液總體積（mL）/取樣量（g）。

1.3.7 有機(jī)硒含量的計(jì)算。

有機(jī)硒含量=總硒含量-無機(jī)硒含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用氫化物發(fā)生原子熒光譜法測定“1.3.2”中硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度，以硒標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以硒熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作圖（圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為IF=56.54C+3.47，回歸系數(shù)r=1.000 0，表明硒濃度在0～32 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 葉面噴硒對蛇莓總硒的影響

從表1可以看出，對蛇莓進(jìn)行葉面噴硒后其總硒含量從0.45 μg/g增加到35.12 μg/g，其最大值是CK的78.04倍。差異分析表明，其相鄰2個(gè)處理間總硒的含量均呈顯著性差異（見表1）。分析認(rèn)為，葉面噴硒對蛇莓總硒含量的影響較大。

2.3 葉面噴硒對蛇莓無機(jī)硒的影響

由表1可知，采用葉面噴硒后，蛇莓中的無機(jī)硒含量變化較大，無機(jī)硒含量從0.15 μg/g增加到18.49 μg/g，其最大值是CK值的126.06倍。差異分析表明，處理T1～T4 隨著噴硒濃度的增加不存在顯著性差異，但處理T5～T9存在顯著性差異。分析認(rèn)為，當(dāng)葉面噴硒濃度小于16 ng/mL時(shí)，蛇莓中無機(jī)硒的含量受葉面噴硒的影響不大，然而當(dāng)葉面噴硒濃度大于32 ng/mL時(shí)，蛇莓中無機(jī)硒的含量受葉面噴硒的影響較大。

2.4 葉面噴硒對蛇莓有機(jī)硒的影響

隨著葉面噴施亞硒酸鈉濃度的增加，有機(jī)硒含量逐漸增加，其值從0.30 μg/g逐漸增加到20.94 μg/g，當(dāng)蛇莓葉面噴硒濃度達(dá)到256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的含量達(dá)到最大值，而當(dāng)噴硒濃度大于256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的含量顯著降低（見表1）。差異分析表明，除了處理T1和T2之間不存在顯著性差異外，其他相鄰處理間均存在顯著性差異。分析認(rèn)為，采用葉面噴適當(dāng)濃度的亞硒酸鈉溶液能明顯增加蛇莓中的有機(jī)硒含量，噴施亞硒酸鈉溶液的濃度太高會降低蛇莓中的有機(jī)硒的含量。

2.5 葉面噴硒對蛇莓有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可知，有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率從處理T1～T4逐漸增加，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度16 ng/mL，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.5%。但從處理T5～T9逐漸降低，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度為512 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率降低到47.3%，該處理有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于CK值。分析認(rèn)為，噴施亞硒酸鈉濃度16 ng/mL時(shí)最有利于將蛇莓中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。從表1的分析結(jié)果可知，雖然此處理有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率最高，但蛇莓中的有機(jī)硒含量尚未達(dá)到最大值。同時(shí)分析結(jié)果還表明，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度大于16 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率雖然有所降低，但是對比CK可以看出處理T6～T8的蛇莓有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率均高于CK。結(jié)果表明，葉面噴施亞硒酸鈉濃度小于或等于256 ng/mL時(shí)，蛇莓并沒有表現(xiàn)出硒中毒，但當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度大于該濃度時(shí)，蛇莓表現(xiàn)出硒中毒，且有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率迅速降低。上述分析表明，蛇莓葉面噴施亞硒酸鈉的最佳濃度為256 ng/mL，并以此亞硒酸鈉濃度對蛇莓進(jìn)行噴施，可以獲得含20.94 μg/g有機(jī)硒的富硒蛇莓。

3 討論

前人研究表明，植物葉面噴硒能顯著提升植物體內(nèi)的硒含量[12-14]。該試驗(yàn)分析結(jié)果表明，葉面噴施亞硒酸鈉溶液顯著提升了蛇莓中的有機(jī)硒的含量，當(dāng)噴施亞硒酸鈉溶液濃度為256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的濃度達(dá)到最大值（20.94 μg/g），是CK的69.8倍。紫云英是目前公認(rèn)的硒集聚植物[15]，張祥明等[13]以360 μg/mL的亞硒酸鈉溶液對紫云英進(jìn)行了3次噴施，并獲得了最大硒含量（總硒含量為13.54 μg/g）的富硒紫云英，為CK的148.79倍。然而，該試驗(yàn)采用256 ng/mL亞硒酸鈉溶液對蛇莓進(jìn)行10次噴施，獲得有機(jī)硒的含量為20.94 μg/g，高于上述紫云英中硒的最大值。分析認(rèn)為，采用低濃度的亞硒酸鈉溶液對植物進(jìn)行多次噴施的方法有利于植物對無機(jī)硒的吸收和轉(zhuǎn)化。

已有研究表明，蛇莓總酚對卵巢癌（SKOV-3）、宮頸癌（HeLa）、子宮內(nèi)膜癌（HEC-1B）、鼻咽癌（CNE）、胃癌（BGC-823）、肺癌（NCI-H460）細(xì)胞的增殖有良好的抑制作用[16-18]。同時(shí)，前人已證實(shí)了甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]等有機(jī)硒具有較強(qiáng)的抗癌活性。由于有機(jī)硒的藥效遠(yuǎn)高于無機(jī)硒，因此若蛇莓中的抗癌活性成分與硒結(jié)合，可能會生成對癌癥有獨(dú)特療效的含硒活性成分。然而，含硒活性成分必須從有機(jī)硒含量很高的蛇莓中提取，在自然條件下生長的蛇莓有機(jī)硒含量很低，很難從中提取含硒活性成分。該研究通過葉面噴硒的方式獲得了有機(jī)硒高度富集的蛇莓，并有可能從富硒蛇莓中提取對癌細(xì)胞有顯著抑制活性的含硒活性成分。由于該試驗(yàn)采用盆栽方式對蛇莓進(jìn)行富硒培育，所以獲得的富硒蛇莓樣品較少，因此尚未對富硒蛇莓中有機(jī)硒的賦存形態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)的分析。目前，筆者已在室外對蛇莓進(jìn)行大量的種植，并利用該研究成果對蛇莓進(jìn)行富硒培育，然后對富硒蛇莓進(jìn)行有機(jī)硒的提取，并用制備液相色譜法分離出不同成分的有機(jī)硒，再采用核磁共振、紅外光譜、高效液相色譜-質(zhì)譜連用等技術(shù)表征有機(jī)硒的結(jié)構(gòu)，最后將分離出來的有機(jī)硒進(jìn)行抗癌活性的檢測，以期為天然含硒抗癌新藥的研制提供重要參考。

4 結(jié)論

葉面噴施亞硒酸鈉能有效增加蛇莓葉中有機(jī)硒的含量，采用256 ng/mL的亞硒酸鈉溶液對蛇莓葉面進(jìn)行10次噴施，每10 d噴硒1次可以獲得有機(jī)硒含量較高的富硒蛇莓，其有機(jī)硒含量高達(dá)20.94 μg/g。

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