雜交水稻稻曲病原真菌的分離與鑒定

左山 張沫雨 劉雯滍 黎妮 王偉平

摘要 [目的]分離獲得與鑒定引發(fā)雜交水稻稻曲病的病原真菌。[方法]通過(guò)微生物培養(yǎng)方法及多相分類鑒定技術(shù)，對(duì)引發(fā)雜交水稻稻曲病害的病原真菌進(jìn)行分離與鑒定。[結(jié)果]該研究分離獲得了引發(fā)稻曲病病害的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)病原菌種，并鑒定為稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步防治水稻稻曲病病原真菌與減少稻曲病病害發(fā)生奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 雜交水稻；稻曲病；病原真菌；稻綠核菌

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0108-03

Separation and Identification of Pathogenic Fungus of False Smut in Rice from Hybrid Rice

ZUO Shan1，ZHANG Moyu1，LIU Wenzhi1 et al

（1.Beijing Guangqumen High School，Beijing 100062；2.State Key Laboratory of Hybrid Rice （Hunan Hybrid Rice Research Center），Changsha，Hunan 410125）

Abstract [Objective] To isolate and identify the pathogenic fungi that would cause hybrid rice false smut.[Method]To isolate and identify the pathogen strains of false smut from hybrid rice by the methods of microorganism cultivation and polyphasic taxonomic technology. [Result] In this study，the absolutely dominant pathogenic bacteria that caused the disease of rice smut was isolated and identified as Ustilaginoidea virens.[Conclusion] This study laid a scientific foundation for further prevention and control on rice fungal pathogens and reduction of rice smut disease occurrence.

Key words Hybrid rice；False smut in rice；Pathogenic fungi；Ustilaginoidea virens

水稻稻曲病（Rice false smut）廣泛分布在美洲、非洲和亞洲等地區(qū)，其中在我國(guó)發(fā)生突出。在我國(guó)南方稻區(qū)，由于夏秋陰雨天氣頻發(fā)，中晚稻生產(chǎn)稻曲病發(fā)生較重，對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)均造成了較大損失。稻曲病主要由病原真菌侵染水稻稻穗，形成大于谷粒數(shù)倍的菌絲球即稻曲球，且表面覆蓋大量的黃色或墨綠色的厚垣孢子，稻曲球不但嚴(yán)重威脅水稻產(chǎn)量和質(zhì)量，而且能產(chǎn)生對(duì)人和牲畜有劇毒作用的真菌毒素，因此進(jìn)行稻曲病的防治尤為重要[1-7]。

目前稻曲病的防治主要依賴于化學(xué)藥品，其對(duì)環(huán)境污染較為嚴(yán)重，生物防治方法有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究。筆者從雜交水稻稻曲病發(fā)生地采集了大量的稻曲球，對(duì)稻曲病原菌進(jìn)行分離和鑒定，并進(jìn)行菌種保藏，以期為生防菌劑的開(kāi)發(fā)奠定微生物生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 雜交水稻稻曲病發(fā)病種子（稻曲球）由湖南雜交水稻研究中心提供，品種為“深兩優(yōu)5814”，于2016年9月采集，地理坐標(biāo)為112°73′36″E、25°73′08″N。將采集樣品置于4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

玫瑰紅鈉和PDA成品培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋公司；基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TIANGEN公司；PCR引物由上海生工合成。

1.3 稻曲病病原真菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察

選取10顆發(fā)病種子，用無(wú)菌鑷子和刀片刮取種子表面的發(fā)病組織于無(wú)菌水中，然后依次用無(wú)菌水稀釋成濃度為10-1、10-2、10-3的組織懸液。分別取100 μL懸液涂布于玫瑰紅鈉平板上（平板含有25 mg/mL氯霉素和25 mg/mL四環(huán)素），每個(gè)處理3個(gè)平行。將玫瑰紅鈉平板置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，從第2天開(kāi)始對(duì)平板上的單菌落進(jìn)行分離計(jì)數(shù)，共7 d，根據(jù)菌落形態(tài)（包括大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無(wú)滲透液，有無(wú)可溶性色素等）對(duì)可培養(yǎng)真菌進(jìn)行初篩，利用PDA培養(yǎng)基平板純化菌株。將純化好的菌株用試管保藏備份。

1.4 病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

利用基因組DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA，采用通用引物L(fēng)R0R （5′-GTACCCGCTGAACTTAAGC -3′）和LR5 （5′-ATCCTGAGGGAAACTTC -3′）擴(kuò)增菌株26S rDNA 序列[8]。PCR 反應(yīng)體系：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，補(bǔ)充去離子水至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，PCR 產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序序列提交至GenBank。

將序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取相近種的模式菌株序列作為內(nèi)群，選取1個(gè)與待測(cè)菌株同科不同屬的模式菌株序列作為外群，利用ClustalX （1.83）軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，采用MEGA5.0軟件，鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Kimura 2-parameter模型計(jì)算進(jìn)化距離，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算檢驗(yàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

3個(gè)稀釋度共得到約1×103個(gè)菌落，形態(tài)學(xué)初篩大部分菌落形態(tài)特征完全相同，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種，判定該優(yōu)勢(shì)種為稻曲病主要病原菌，隨機(jī)挑取6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌菌落進(jìn)行分純，并保藏于PDA試管斜面中，原始編號(hào)分別為RSF1～RSF6。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

2.2.1 菌落形態(tài)。PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑12～14 mm，白色，表面平坦，質(zhì)地絲絨狀，反面黃色，無(wú)滲出液產(chǎn)生，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生；PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)14 d，菌落直徑25～27 mm，菌絲白色，中央淺黃色，反面蛋黃色，無(wú)滲出液產(chǎn)生，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生（圖2A～D）。

2.2.2 顯微形態(tài)。菌絲纏繞分枝，透明無(wú)色，壁平滑，有橫隔，寬度為2.5～3.0 μm；大量菌絲頂端彎曲成菌環(huán)；菌絲老后，壁加厚，棕色；生殖菌絲變粗，頂部產(chǎn)生分枝，分隔明顯，縊縮斷裂產(chǎn)生厚壁膨大的柱狀孢子（圖2E～L）。

2.3 序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將上述分離得到的6個(gè)純菌株分別提取基因組DNA，對(duì)其26S rDNA序列進(jìn)行測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析，6個(gè)菌株聚為同一系統(tǒng)發(fā)育支，且與稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）序列相似性均為100%，證明6個(gè)菌株為同一菌種，詳見(jiàn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。選取菌株RSF6為代表，將該菌株測(cè)序序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為KX885488。

3 討論與結(jié)論

目前，我國(guó)雜交水稻育種水平較高，但仍存在一些問(wèn)題，如部分品種抗性（抗病蟲(chóng)、抗逆）弱，適應(yīng)生態(tài)環(huán)境能力不強(qiáng)，一些超級(jí)雜交稻品種在推廣中因抗性差，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)減產(chǎn)，造成巨大損失[8]；從另外一個(gè)方面來(lái)看，對(duì)重點(diǎn)病原菌的研究可為制定和實(shí)施合理有效的預(yù)防措施提供科學(xué)的參考依據(jù)。

該研究通過(guò)微生物培養(yǎng)分離方法，從雜交水稻“深兩優(yōu)5814”稻曲球中分離得到病原真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)比對(duì)和核酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法，獲得絕對(duì)優(yōu)勢(shì)病原菌種，并將其鑒定為稻綠核菌，為進(jìn)一步防治該病原真菌與減少水稻稻曲病病害發(fā)生奠定了前期研究基礎(chǔ)。

基于該研究進(jìn)展，下一步將利用多組學(xué)研究技術(shù)開(kāi)展該病原真菌致病機(jī)理與生防拮抗研究，并從種子微生態(tài)學(xué)和“植物與微生物共生體育種” [9]的新視角開(kāi)展雜交水稻的抗稻曲病育種與提質(zhì)研究，這對(duì)于推進(jìn)雜交水稻種子科學(xué)研究及種業(yè)發(fā)展具有重要的理論與實(shí)踐價(jià)值。

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