HPLC法測定黑木耳中腺苷及尿苷含量

鄭雪 鄭春英 吳桐

摘要 [目的]建立簡單、快速同時分析黑木耳中腺苷及尿苷含量的HPLC法。[方法]采用Venusil XBP C18色譜柱，流動相為甲醇-水（15：85），流速為1 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為室溫。[結(jié)果]腺苷及尿苷的線性范圍分別為0.02～0.10 mg/mL（r=0.999 9）和0.04～0.20 mg/mL（r=0.999 9），平均加樣回收率分別為99.58%（RSD=0.78%）、98.99%（RSD=1.21%）。[結(jié)論]該方法簡單、快速、準確、重現(xiàn)性好、回收率高，可用于黑木耳中腺苷及尿苷含量的測定，其結(jié)果可為其質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 HPLC；黑木耳； 腺苷； 尿苷

中圖分類號 TS207；R931 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）32-0173-02

Determination of Adenosine and Uridine in Auricularia auricula by HPLC

ZHENG Xue1，2，ZHENG Chunying1，2，WU Tong1，3 （1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology，Ministry of Education，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150500；2.Key Laboratory of Microbiology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080；3.Key Laboratory of Molecular Biology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective] To develop a HPLC method for simultaneous determination of adenosine and uridine in Auricularia auricular.[Method]The HPLC system consisted of a Venusil XBP C18 column with the mobile phase of methanol-water （15∶85） at a flow rate of 1.0 mL/min.UV detector was used，and the detection wavelength was 260 nm.The column temperature was room temperature.[Result]The liner range of adenosine and uridine were 0.02-0.10 mg/mL（r=0.999 9）and 0.04-0.20 mg/mL（r=0.999 9），respectively.The average recoveries were 99.58%（RSD=0.78%） and 98.99%（RSD=1.21%），respectively.[Conclusion] The method is accurate，simple，rapid and reproducible for determination of adenosine and uridine in Auricularia auricular.The determination results can be used as a reference for the quality control for Auricularia auricular.

Key words HPLC；Auricularia auricular；Adenosine； Uridine

作者簡介 鄭雪（1994—），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。*通訊作者，鄭春英，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物制藥研究；吳桐，講師，從事寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵研究。

收稿日期 2018-09-06

黑木耳（Auricularia auricula）是我國珍貴的食藥用真菌，具有抗腫瘤[1]、抗凝血[2]、抗氧化[3]、降血脂[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等作用。黑木耳中含有多糖[6]、腺苷、尿苷[7]、黃酮[8]等多種活性成分，深受消費者喜愛。關(guān)于黑木耳的質(zhì)量控制方法目前主要有2種，一是針對黑木耳活性成分黑木耳多糖，采用分光光度法[9]進行黑木耳中總多糖的含量測定；此方法操作復(fù)雜，需要用到濃硫酸等腐蝕性較大的試劑，且多糖不易長時間存放，測定結(jié)果容易受到溫度、時間等多種因素的影響。二是針對黑木耳中的總黃酮成分，采用比色法進行測定[10]，此法簡單粗糙、干擾因素多、結(jié)果不可靠。HPLC法具有快速、高效、準確度高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點，筆者采用HPLC法，以黑木耳中主要活性成分尿苷及腺苷為指標(biāo)，建立黑木耳中尿苷及腺苷的含量測定方法，為黑木耳的質(zhì)量控制研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 不同產(chǎn)地黑木耳樣品均購于哈爾濱市家樂福超市，樣品現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實驗室。腺苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；尿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

FL2200高效液相色譜儀（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）；KQ100-DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電子天平（METTLER TOLEDO，美國）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。儀器為FL2200，色譜柱為Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（15∶85），流速為1 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備。精密稱取黑木耳粉（40目）10 g，加入400 mL 50%甲醇（V/V）溶液，超聲提取2次，每次60 min，離心、過濾，取上清減壓蒸發(fā)至近干，再以50%甲醇（V/V）定容至25 mL，0.45 μm的微孔濾膜濾過后作為供試品溶液。

1.3.3 線性關(guān)系考察。分別精密稱取腺苷和尿苷對照品適量，以50%甲醇（V/V）配制成腺苷、尿苷質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2 mg/mL的混合對照品儲備液；精密吸取混合對照品儲備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于2 mL容量瓶中，以50%甲醇（V/V）定容，搖勻，得到系列腺苷、尿苷混合對照品溶液。分別吸取此系列混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以各物質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準曲線。

1.3.4 方法學(xué)考察。在黑木耳樣品中選一個樣品，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，測定儀器進樣精密度；所選取的樣品溶液分別在0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL測定其峰面積，考察樣品的日內(nèi)穩(wěn)定性，同時，取上述樣品溶液在配制6 d內(nèi)每日進樣，測定各組分的峰面積積分值，考察樣品的日間穩(wěn)定性；取同一黑木耳樣品6份，平行制備樣品溶液并測定該方法的重現(xiàn)性；精密稱取同一已知含量的黑木耳樣品，共6份，精密加入一定量的尿苷、腺苷對照品，按“1.3.2”供試液制備方法制備樣品，在“1.3.1”色譜條件下進樣10 μL，計算的回收率。

1.3.5 顆粒度對提取率的影響。分別準確稱取20、40、60、80目黑木耳粉各10 g，以料液比1∶40的50%甲醇超聲提取2次，每次60 min，測定腺苷、尿苷含量。

1.3.6 料液比對提取率的影響。準確稱取黑木耳粉（40目）10 g，以50%甲醇超聲提取2次，每次60 min，分別在料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的條件下提取黑木耳樣品，檢測腺苷、尿苷含量。

1.3.7 樣品測定。分別取不同產(chǎn)地黑木耳樣品粉末，按“1.3.2”項下平行制備3份供試品液，按“1.3.1”項下條件測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

2.2 方法學(xué)考察

2.3 顆粒度對提取率的影響

黑木耳具有膠質(zhì)含量高、黏度大、吸水性強等特點，因此該研究比較了黑木耳樣品顆粒度對提取率的影響，其結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，隨黑木耳樣品顆粒度的減小，黑木耳中腺苷及尿苷的提取率先增大再降低。當(dāng)顆粒度過小時，可能是由于黑木耳樣品顆粒太細，部分樣品漂附在提取溶劑表面，導(dǎo)致提取率出現(xiàn)波動現(xiàn)象。當(dāng)黑木耳顆粒度為40目時（n=6），腺苷和尿苷均有最大提取率。

2.4 料液比對提取率的影響

黑木耳樣品的強吸水性導(dǎo)致提取溶劑消耗量較大，為保證提取完全，在此考察了料液比對提取率的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，料液比由1∶20 擴大到1∶40時，腺苷和尿苷的提取率都有所上升，當(dāng)料液比繼續(xù)擴大時，提取率變化不大。因此從節(jié)約成本考慮，料液比以1∶40為宜。

2.5 樣品測定結(jié)果 采用HPLC法測定黑龍江省不同產(chǎn)地黑木耳樣品中腺苷及尿苷含量，其結(jié)果見圖3及表3。

3可以看出，不同產(chǎn)地黑木耳樣品中腺苷及尿苷含量不同，其中哈爾濱生產(chǎn)的黑木耳樣品中腺苷含量最高（0.153 6 mg/g），海林生產(chǎn)的黑木耳樣品中尿苷含量最高（0.817 4 mg/g）。

3 結(jié)論

HPLC法具有分離效能高、分析速度快等優(yōu)點，近年來已普遍應(yīng)用于食品、藥品中活性成分的定量分析。

該研究首次采用HPLC法測定黑木耳中腺苷和尿苷的含量，并對6種不同生產(chǎn)產(chǎn)地的黑木耳樣品進行分析，試驗結(jié)果表明，該方法操作簡便、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好，可以準確測定黑木耳中腺苷及尿苷的含量，能夠為黑木耳的質(zhì)量控制提供參考。

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