辣椒對(duì)疫霉抗性的快速鑒定

赫衛(wèi) 張慧 王瑩

摘要 研究發(fā)現(xiàn)葉、莖、莖基部和果實(shí)接種4種方法均能用于鑒定辣椒對(duì)辣椒疫霉的抗性。葉與莖接種法操作簡(jiǎn)單，接種部位發(fā)病快，可同時(shí)檢測(cè)大量品種，但要求空氣濕度大；莖基部接種法模擬田間病害的發(fā)生過(guò)程，最能反映品種的真實(shí)抗性，但需要菌量大，工作量也大；果實(shí)接種法不僅操作簡(jiǎn)單、接種部位發(fā)病快、菌需求量小，而且可同時(shí)篩選大量品種，可以通過(guò)量化達(dá)到有效區(qū)分抗病和感病品種的目的，更具有完整保存原有植株的優(yōu)勢(shì)。

關(guān)鍵詞 辣椒疫??； 抗病性； 鑒定

中圖分類號(hào)： S 436.418

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017261

Abstract By comparing different methods of leaf， stem， stem base and fruit inoculation， it was found that all the four methods could be used to identify the resistance of pepper to Phytophthora capsici. Leaf and stem inoculation methods are simple in operation and quick in infection， and could be used to detect a large number of varieties at the same time， but the high air humidity is required. The inoculation in stem base basically simulates the occurrence of field disease， which can reflect the real resistance of cultivars， but large amount of fungus and workload are required. Fruit inoculation method is not only simple in operation， quick in infection， small in inoculum size demand， but also can screen a large number of varieties at same time. The fruit method can be used for the effective distinction between resistant and susceptible varieties by quantifying， and has the advantage of preserving the original plant.

Key words Phytophthora capsici； resistance； identification

由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起的辣椒疫病已成為影響辣椒生產(chǎn)的主要病害之一，其主要特征是發(fā)病周期短，流行速度快，發(fā)病面積大。病原菌通過(guò)孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生的游動(dòng)孢子侵入植物的根、莖、葉、花和果實(shí)[1]。游動(dòng)孢子除主要通過(guò)雨水或灌溉水在土壤中傳播并引起大面積死苗外，還可以通過(guò)氣流傳播。目前，抗病品種的選育和推廣是控制辣椒疫病的主要手段。而抗性鑒定常采用的接種方法為離體葉片接種[23]和游動(dòng)孢子液灌根接種[3]。雖然這兩種接種方法均可以區(qū)分不同辣椒品種對(duì)辣椒疫霉的反應(yīng)，但是這兩種方法卻都有著自身無(wú)法克服的缺點(diǎn)，比如：離體葉片接種法是依據(jù)病斑面積占葉面積的比例作為病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的，由于品種間葉片面積相差較大，因此在接種量一樣的情況下，根據(jù)病斑面積進(jìn)行比較就無(wú)法反映出品種的抗性，同時(shí)離體葉片法不適宜進(jìn)行量化，因而不好分級(jí)，只能進(jìn)行初步的鑒定；游動(dòng)孢子液灌根接種法基本上是模擬田間病害的發(fā)生過(guò)程，能反映品種的真實(shí)抗性，但是需要培養(yǎng)孢子，尤其是當(dāng)鑒定的品種數(shù)量較多的時(shí)候，需要大量的孢子，工作量大，操作較復(fù)雜。為了獲得簡(jiǎn)單有效的方法鑒定辣椒對(duì)疫霉的抗性，本試驗(yàn)用4種不同的方法，為選擇合適的辣椒抗疫病品種的篩選方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取8份辣椒品種或品系為試材。播種前用52～55℃的溫水浸種30 min，1%硫酸銅溶液浸泡5 min進(jìn)行種子消毒處理，然后用清水沖洗干凈，再浸種催芽后播種至穴盤內(nèi)。葉、莖和莖基部接種法在辣椒的4～6葉期接種。

1.2 辣椒疫霉的培養(yǎng)

將在室內(nèi)低溫保存的辣椒疫霉菌種接種在燕麥固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在25～28℃下恒溫暗培養(yǎng)3 d至白色菌絲充分生長(zhǎng)繁殖布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，然后在25～28℃恒溫下光/暗交替培養(yǎng)7 d至產(chǎn)生孢子囊。用無(wú)菌水沖洗后4℃放置30 min即可用于葉和莖接種法，孢子濃度為1 000孢子/mL。

1.3 接種方法

1.3.1 葉接種法

選取4～6葉期健康的活體植株頂端展開(kāi)葉，用滅菌刷子在葉片正面上制造淺細(xì)傷口，將制備好的菌液用刷子刷在葉片上。每個(gè)品種接10株，重復(fù)3次，共30株。在溫室自制玻璃箱內(nèi)接種及培養(yǎng)，自然光照，溫度25～30℃，相對(duì)空氣濕度90%～95%，以滅菌水為對(duì)照，接種后每隔24 h調(diào)查記錄1次發(fā)病情況。

1.3.2 莖接種法

選取4～6葉期健康的活體植株子葉上部莖，用滅菌接種針劃破表皮制造3個(gè)傷口，將制備好的菌液用滅菌刷子刷在傷口上，用塑料薄膜包扎保濕24 h后除去薄膜。培養(yǎng)條件同1.3.1。

1.3.3 莖基部接種法

選取4～6葉期健康無(wú)病的活體植株莖基部，將菌塊埋在距植株1 cm土壤0.5 cm深處，適時(shí)澆水以保持土壤濕度達(dá)到飽和。培養(yǎng)條件同1.3.1。

1.3.4 果實(shí)接種法

選取健康完整青果期的辣椒果實(shí)用滅菌水沖洗后，再用乙醇沖洗滅菌，在鐵盤內(nèi)墊上雙層濕濾紙，將辣椒果實(shí)放在上面，用滅菌刀片在果實(shí)上切去直徑7 mm表皮，從準(zhǔn)備好的菌盤上切割邊長(zhǎng)5 mm的菌餅，將菌餅有菌絲的一面緊貼在傷口上，在30℃光照16 h后，25℃黑暗培養(yǎng)8 h，采用保鮮膜覆蓋在鐵盤上面保濕，促使病害的發(fā)生。以不含菌的培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.4 調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)

葉、莖、莖基部接種3種方法不適宜進(jìn)行分級(jí)，只能進(jìn)行定性觀察。果實(shí)接種法調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)分5級(jí)（圖1）：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，果面上出現(xiàn)水浸狀病斑，病斑直徑≤2 cm；2級(jí)，果面上出現(xiàn)水浸狀病斑，2 cm<病斑直徑<4 cm；3級(jí)，果面上的水浸狀病斑已嚴(yán)重變軟，果表皮與果肉分離，病斑直徑≥4 cm；4級(jí)，果面上的水浸狀病斑已完全或幾乎覆蓋果實(shí)表面。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病果數(shù)×相對(duì)級(jí)值）/（調(diào)查總果數(shù)×最高級(jí)值）×100；

抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)：抗病（R），病情指數(shù)≤15；中抗（MR），15<病情指數(shù)≤30；中感（MS），30<病情指數(shù)≤50；感?。⊿），病情指數(shù)>50。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉接種后的發(fā)病情況

接種后5 d即可發(fā)病?？共≈仓陚谔幾兒郑“弑葌诼源?，并不再向外擴(kuò)展（圖2b）。感病植株先在傷口處形成褐色病斑，逐漸發(fā)展，葉片病斑變黑，整個(gè)葉片皺縮萎蔫，病斑沿葉柄向莖擴(kuò)展，直至根部，造成整個(gè)植株萎蔫，最后死亡（圖2c～d）。對(duì)照在傷口處變白，沒(méi)有任何病變（圖2a）。

2.2 莖接種后的發(fā)病情況

接種后5 d即可發(fā)病?？共≈仓陜H傷口處變褐縊縮，病斑并不向外擴(kuò)展（圖2f），莖部的局部病變縊縮有可能使傷口上部的組織整體掉落，留下斷莖。感病植株在切口處形成黑褐色病斑，病斑沿莖稈向上和向下擴(kuò)展，直至根部，造成植株萎蔫，最后死亡（圖2g～h）。對(duì)照在傷口處變白，沒(méi)有任何病變（圖2e）。在接種后20 d，抗病植株在留下的斷莖上生出新的葉片，植株繼續(xù)生長(zhǎng)，說(shuō)明這些抗病植株對(duì)辣椒疫病有一定的耐受性。

2.3 莖基部接種后的發(fā)病情況

接種后10 d發(fā)病，抗病植株莖基部變褐，病斑并不擴(kuò)展（圖2j）。感病植株在莖基部形成黑褐色病斑，莖基部變黑縊縮，病斑沿莖稈擴(kuò)展，造成植株萎蔫，最后死亡（圖2k～l）。對(duì)照在莖基部沒(méi)有任何變化（圖2i）。

2.4 果實(shí)接種后的發(fā)病情況

接種后3 d，有少數(shù)幾份品種開(kāi)始發(fā)病，第5天時(shí)全部品種都表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，但也有一些品種的部分辣椒果實(shí)未發(fā)病。發(fā)病初期，疫霉從切口處開(kāi)始擴(kuò)散，先在果內(nèi)長(zhǎng)出少量菌絲，隨后果外出現(xiàn)水浸狀病斑，當(dāng)果內(nèi)長(zhǎng)出大量菌絲，果外水浸狀病斑迅速擴(kuò)展，果實(shí)剖面呈褐色，病果果肉松軟，直至果皮和果肉分離，徹底腐爛，菌絲在傷口處或果柄處外露（圖3）。對(duì)照在切口處干枯，無(wú)發(fā)病癥狀。

果實(shí)接種法可以很好地區(qū)分抗病和感病品種?？共∑贩N在切口處無(wú)病斑，或切口周圍變褐，病斑向外略有擴(kuò)展即被遏制，病斑擴(kuò)展緩慢，而感病品種則在切口處形成水浸狀褐色病斑，病斑向外擴(kuò)展，造成果肉和果皮分離，直至整個(gè)果腐爛。

應(yīng)用果實(shí)接種法可以區(qū)分辣椒品種對(duì)疫病抗性。不同品種抗病性呈現(xiàn)明顯不同（圖4）。選取其中8個(gè)品種進(jìn)行鑒定，根據(jù)病情指數(shù)與抗病性的關(guān)系，可以判斷‘ICPN21-03、‘隴椒5號(hào)為中抗品種，‘紅椒王，‘B16142、‘龍椒951、‘野生椒、‘B16166、‘ICPN21-08為感病品種（圖4和表1）。這說(shuō)明，果實(shí)接種法可用于辣椒品種對(duì)疫霉的抗性劃分。

果實(shí)接種法選取辣椒果作為鑒定對(duì)象具有一致性。辣椒果實(shí)作為試驗(yàn)材料，病斑雖有分級(jí)，但絕大部分位于一個(gè)抗病調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，總體表現(xiàn)比較均一。說(shuō)明辣椒果實(shí)作為抗病鑒定材料表現(xiàn)穩(wěn)定（圖4）。

3 結(jié)論與討論

3.1 3種活體接種方法的比較

本試驗(yàn)摸索了3種活體鑒定方法，發(fā)現(xiàn)這3種接種方法均可使辣椒在幾天內(nèi)發(fā)病，并可區(qū)分辣椒品種對(duì)疫霉的反應(yīng)，3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可以根據(jù)需要選擇適宜的接種方法。

以辣椒葉片為接種材料，接種葉片在幾天內(nèi)發(fā)病，并很快蔓延至整株，可快速鑒定對(duì)疫霉的抗性。葉接種法操作簡(jiǎn)單，能夠同時(shí)檢測(cè)大量品種，但與葉部噴霧接種法[45]一樣，需長(zhǎng)時(shí)間保濕來(lái)增加侵染效率。要求空氣濕度達(dá)到90%左右，空氣濕度不一致會(huì)導(dǎo)致發(fā)病情況不一致，空氣濕度保持均勻一致時(shí)，同批供試材料的抗性結(jié)果基本一致。即空氣濕度的強(qiáng)度和均一性是制約葉片侵染法的主要因素。由于不同品種辣椒的葉片面積相差較大，葉接種法在接種量方面存在差異，根據(jù)病斑面積不能進(jìn)行病情分級(jí)。

莖接種法同樣操作簡(jiǎn)單，接種后發(fā)病快，可以同時(shí)檢查大量品種。莖接種法可通過(guò)接種后病斑長(zhǎng)度變化來(lái)反映病斑的擴(kuò)展速度，適宜對(duì)抗性量化。根據(jù)病斑擴(kuò)展的速度即可區(qū)別品種間的抗性差異。因莖接種部位的上部莖葉有受侵染后整體脫落形成斷莖的現(xiàn)象，部分接種后植株的病斑長(zhǎng)度不能測(cè)量，無(wú)法判斷受害等級(jí)。且莖接種法對(duì)空氣濕度要求高，空氣濕度同樣制約侵染效率和發(fā)病程度?？諝鉂穸缺３志鶆蛞恢聲r(shí)，同批供試材料的抗性結(jié)果基本一致。莖接種法與葉接種法[4，6]同樣因缺少病原菌與根際微生物間的相互作用而與田間侵染不符。

莖基部接種法更接近田間病害的發(fā)生過(guò)程，最能反映品種的真實(shí)抗性，不過(guò)，該法需要培養(yǎng)孢子囊，當(dāng)鑒定品種數(shù)量多時(shí)，需要菌量大，工作量大。接菌量少時(shí)，發(fā)病耗時(shí)長(zhǎng)，侵染效率低。研究者嘗試采用在土壤中包埋菌塊來(lái)替代澆灌菌液的方法，解決灌根法[78]中對(duì)菌量的需求，但沒(méi)有達(dá)到預(yù)期目的。

3.2 辣椒果實(shí)接種法的優(yōu)劣

果實(shí)接種法的優(yōu)勢(shì)在于接種后發(fā)病時(shí)間短，傷口的存在為侵染提供了便利，縮短了發(fā)病時(shí)間。接種后3 d，接種部位發(fā)病，5 d感病品種大部分腐爛變軟。果實(shí)接種法采用菌餅接種，這種方式對(duì)病菌的需求量小，一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)的菌絲可以接種40個(gè)果左右，解決了大量培養(yǎng)菌耗時(shí)耗力的問(wèn)題。果實(shí)接種法可以應(yīng)用于各種辣椒品種，基本不受果形限制。

果實(shí)接種法可以根據(jù)病斑擴(kuò)展的速度區(qū)別品種間的抗性差異，對(duì)抗性進(jìn)行量化，能有效區(qū)分抗感疫病品種。

果實(shí)接種法基于同一辣椒品種的果實(shí)對(duì)疫病抗性的一致性，可每個(gè)品種選取3個(gè)果實(shí)作為試材進(jìn)行初步篩選，經(jīng)初步篩選后的材料再采取辣椒果實(shí)鑒定方法或其他鑒定方法進(jìn)一步大量接種鑒定。采用果實(shí)接種法進(jìn)行初步篩選，快速簡(jiǎn)便，操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)篩選大量品種，有利于抗疫病品種的快速篩選。

果實(shí)接種法以離體果實(shí)為研究對(duì)象，能夠在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)多個(gè)品種，對(duì)辣椒植株無(wú)任何損傷，不影響植株的生長(zhǎng)，辣椒原有植株可用于其他試驗(yàn)或取種。即使是感病品種，也能在進(jìn)行抗疫病鑒定的同時(shí)保存品種資源，在對(duì)種質(zhì)資源稀少的品種進(jìn)行抗疫病鑒定方面有優(yōu)勢(shì)。另外，果實(shí)接種法鑒定在辣椒青果期的任何階段都可以進(jìn)行，試驗(yàn)周期短，試驗(yàn)時(shí)間充足。

果實(shí)接種法的缺點(diǎn)在于以離體的果實(shí)作為鑒定材料，不存在系統(tǒng)抗性反應(yīng)。另外，濾紙的濕度要保持一致，避免濕度過(guò)大導(dǎo)致果實(shí)過(guò)度腐爛，影響病級(jí)判定。對(duì)于果實(shí)太小的品種，如圓球形的果實(shí)，也存在病級(jí)判定的問(wèn)題。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）