谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶改善內(nèi)酯豆腐凝膠強度的作用機理

楊海鵬，華欲飛，陳業(yè)明，張彩猛，孔祥珍

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214222)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase，簡稱TGase或TG酶)是一種催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成ε-(γ- 谷氨?；?賴氨酸共價鍵的酶,可以催化蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)，將蛋白質(zhì)分子黏合起來，改善蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性等功能特性[1-2]。目前廣泛應(yīng)用于牛、豬、雞肉等肉制品及豆制品的黏合，改善其口感、風味、組織結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)，提高產(chǎn)品附加值[3-6]。

內(nèi)酯豆腐是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白食品，是大豆蛋白在GDL作用下相互結(jié)合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠產(chǎn)品。其形成機理是GDL在室溫下水解為葡萄糖酸，使豆?jié){pH值降低至大豆蛋白的等電點從而使豆?jié){凝固，形成內(nèi)酯豆腐[7-8]。雖然其口感光滑細膩、營養(yǎng)價值高、充填包裝便于攜帶等優(yōu)點，但是市售內(nèi)酯豆腐普遍較軟，常用于涼拌，不易烹飪進一步加工食用[9-10]。本實驗通過研究不同TG酶作用條件對內(nèi)酯豆腐凝膠強度的改善作用及TG酶的作用機理，為實際生產(chǎn)中TG酶的應(yīng)用及內(nèi)酯豆腐品質(zhì)的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，普通大豆為市售東北大豆，成分缺失大豆由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，江西新黃海醫(yī)藥食品化工有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，上海東圣食品有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R250，Sigma-Aldrich公司；標準分子量蛋白，伯樂生命醫(yī)藥產(chǎn)品(上海)有限公司；甘油、溴酚藍、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)等，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

BLST4090B-073豆?jié){機，匯勛電器制品有限公司；垂直電泳儀、凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；TA-XT2質(zhì)構(gòu)儀，美國TA儀器公司。

1.3 工藝流程及操作要點

大豆→浸泡→磨漿→煮漿及冷卻→加內(nèi)酯及TG酶→保溫處理→滅酶及冷卻→酶促內(nèi)酯豆腐

浸泡：用去離子水清洗，25 ℃下以體積分數(shù)0.5%的NaHCO3溶液浸泡12 h。

磨漿：干豆水比1∶7(g∶mL)磨漿后稀釋得到固形物含量為8%、pH6.86、蛋白質(zhì)含量3.60%的生漿。

煮漿及冷卻：水浴加熱豆?jié){中心溫度95 ℃下保溫5 min，迅速冷卻到30 ℃以下。

加內(nèi)酯及TG酶：市售葡萄糖酸內(nèi)酯為顆粒狀，易溶于水；TG酶為粉末狀，加入水中易聚集；故以溶液方式加入，先內(nèi)酯，再加入TG酶，并充分攪拌。

滅酶及冷卻：TG酶在70 ℃仍有一定活性，選擇95 ℃水浴保溫10 min方式滅酶；4 ℃保存以備凝膠強度測量及其他分析。

此外還有基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮生長因子C、抗胞質(zhì)角蛋白、PTEN基因等作為宮頸癌微轉(zhuǎn)移檢測的標志物，但文獻報道較少，而這些標志物均需要大樣本的研究及探索去證實其有效性。

1.4 實驗方法

1.4.1 TG酶作用條件對內(nèi)酯豆腐凝膠強度的影響

以內(nèi)酯豆腐凝膠強度為指標進行研究。分別研究GDL添加量(0.10%TG酶量，GDL添加量為0、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%；50 ℃+1 h保溫處理)(添加量均以質(zhì)量分數(shù)表示)、TG酶添加量(0.30%GDL量，TG酶量為0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%；50 ℃+2 h保溫處理)、保溫溫度(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保溫溫度：40、45、50、55、60 ℃，保溫2 h)、保溫時間(0.30%GDL量，0.10%TG酶量，不同保溫時間：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，保溫溫度50 ℃)對內(nèi)酯豆腐凝膠強度的影響。

1.4.2 內(nèi)酯豆腐凝膠強度的測定

采用質(zhì)構(gòu)儀中P25探頭選擇穿刺模式，所有樣品均為50 mL豆?jié){初樣放置100 mL燒杯中測量，平行測定3次[11]。測試條件：壓縮距離10 mm，測前速度3 mm/s，測中1 mm/s，測后3 mm/s。

1.4.3 SDS-PAGE凝膠電泳樣品的制備和分析

豆腐的凝膠電泳方法參照LAEMMLI[12]和閆尊浩[13]的方法。TG酶作用下的內(nèi)酯豆腐凝膠強度提高，更不易溶于水，取少許豆腐研碎后，用6%的SDS溶液(體積分數(shù))稀釋10倍，并攪拌至完全溶解。蛋白電泳中單一條帶的相對含量均以第1泳道對應(yīng)條帶含量為參考量1，進行相對含量分析。

1.4.4 統(tǒng)計分析

內(nèi)酯豆腐的凝膠強度平行測定3次，結(jié)果以平均值表示。采用Origin8軟件作圖，SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TG酶作用條件對內(nèi)酯豆腐凝膠強度的影響

由圖1-a及實驗現(xiàn)象可知，當GDL添加量小于0.20%時，體系pH較高，豆?jié){不凝固、不成形；當GDL添加量為0.25%～0.35%，體系pH繼續(xù)下降，接近大豆蛋白的等電點，酶促內(nèi)酯豆腐的凝固狀況改善，凝膠強度也隨之增大；GDL添加量大于0.35%，體系pH值繼續(xù)下降，酶促內(nèi)酯豆腐中開始析出黃漿水，且黃漿水的質(zhì)量增加，凝膠強度下降，結(jié)構(gòu)變得粗糙出現(xiàn)孔洞，直至變成松散的漿體。GDL添加量為0.30%時，酶促內(nèi)酯豆腐凝膠狀況最佳，且凝膠強度最大，故GDL的最佳添加量為0.30%。

圖1 GDL量(a)、TG酶量(b)、保溫溫度(c)、保溫時間(d)對酶促內(nèi)酯豆腐凝膠強度的影響
Fig.1 Effect of GDL concerntration(a)，TGase concerntration(b)，reaction temperature(c)，reaction time(d) on rupture strength of lactone Tofu

圖1-b顯示,加入TG酶可顯著增強豆腐的凝膠強度，當酶添加量為0.05%時，凝膠強度達到最大；繼續(xù)增加TG酶量，內(nèi)酯凝膠強度逐漸下降。因此，最佳TG酶添加量為0.05%。SAKAMOTO等[14-15]研究發(fā)現(xiàn),隨著TG酶量增大,蛋白質(zhì)分子表面的作用位點可能很快被交聯(lián)而降低了其與周圍其他蛋白分子進行交聯(lián)的幾率，因而形成的分子間交聯(lián)要比加酶量小的情況要少，而對凝膠強度起改善作用的，應(yīng)該是蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)形成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，當TG酶量為0.05%時，交聯(lián)后的蛋白聚集體相對較小，在體系分布中均勻，進一步增大TG酶量，蛋白聚集體進一步交聯(lián)，形成更大的交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在整個體系中分布不均勻，不平衡的結(jié)構(gòu)就容易被破壞，凝膠強度變小。

圖1-c顯示隨反應(yīng)溫度的增加，酶促內(nèi)酯豆腐的凝膠強度逐漸增加，當溫度達到50～55 ℃之間時，凝膠強度達到最大；隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)增加，凝膠強度會顯著下降。不同保溫溫度，TG酶作用下內(nèi)酯豆腐的凝膠強度、TG酶的酶活性及TG酶作用下內(nèi)酯豆腐蛋白組分變化情況具有一定的相關(guān)性。相關(guān)實驗證明，不同溫度下，TG酶作用下內(nèi)酯豆腐凝膠強度的變化與TG酶的酶活變化具有一致性。因此，TG酶作用較合適的溫度為50～55 ℃之間。

圖1-d顯示隨保溫時間的延長，酶更能與蛋白充分作用，使凝膠強度逐漸增加，但考慮生產(chǎn)、成本因素，作用時間應(yīng)控制在合量的范圍內(nèi)，故本實驗選3 h為最長保溫時間。

2.2 TG酶作用條件對蛋白組分的影響

2.2.1 TG酶添加量對內(nèi)酯豆腐蛋白組分的影響

由圖2分析可知，當TG酶添加量由0增加到0.05%時，α’、α亞基亦大幅度下降至條帶消失，A3肽鏈直接消失，β、γ亞基和A肽鏈均有明顯下降；隨著TG酶量繼續(xù)增加，β亞基、γ亞基、A肽鏈、聚合體和B肽鏈的相對含量均繼續(xù)緩慢下降，但B肽鏈變化程度最小。由此推測，7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關(guān)系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關(guān)聯(lián)的是11S中的B肽鏈。

圖2 不同TG酶添加量下酶促內(nèi)酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.2 Effect of TGase concerntration on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

2.2.2 保溫溫度對內(nèi)酯豆腐蛋白組分的影響

由圖3分析可知，電泳條帶中7S主要成分α’、α、β、γ亞基，以及11S中的A肽鏈的相對含量的變化與前兩者呈負相關(guān)關(guān)系，A3肽鏈只有在70℃酶活比較低的時候存在；且不同溫度下，11S中B肽鏈的相對含量變化不明顯。不同溫度直接影響TG酶作用的活性，進而影響7S和11S分子間的交聯(lián)，同時影響酶促內(nèi)酯豆腐的凝膠強度。因此，可得到同2.3.2一致的結(jié)論：7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關(guān)系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關(guān)聯(lián)的是11S中的B肽鏈。

圖3 不同保溫溫度下酶促內(nèi)酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.3 Effect of reaction temperature on reducing SDS-PAGE and protein composition of lactone tofu

2.2.3 保溫時間對內(nèi)酯豆腐蛋白組分的影響

如圖4所示，隨著TG酶作用時間的延長，濃縮膠上端含量逐漸增加，與TG酶作用下分子間交聯(lián)形成更大分子量成分有關(guān)； 7S中α’和α亞基大幅度下降，β和γ亞基也明顯下降；11S中A3肽鏈在1 h時直接消失，A肽鏈也明顯下降，但B肽鏈先維持不變后有少量下降。TG酶作用時間從0.5～1 h時，凝膠強度增度最大，同時電泳中α’、α亞基及A3肽鏈明顯下降或消失不見，由此推測這3種成分與TG酶作用關(guān)系最為顯著，其次為β、γ亞基和A肽鏈，最后可能有關(guān)系的是B肽鏈[16]。

圖4 不同保溫時間酶促內(nèi)酯豆腐蛋白還原電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.4 Effect of reaction time on reducing SDS3PAGE and protein composition of lactone tofu

2.3 大豆品種對內(nèi)酯豆腐凝膠強度及蛋白組分的影響

不同品種大豆之間，蛋白質(zhì)組成及含量,影響豆腐的品質(zhì)特性[17-18]。圖5顯示，對于低溫內(nèi)酯豆腐(未加TG酶)，凝膠強度除7S-大豆稍低，其他3者相差不大，即LOX缺失對內(nèi)酯豆腐凝膠強度影響不明顯，但7S缺失降低了其凝膠強度；對于酶促內(nèi)酯豆腐，豆王牌>恒豐牌>LOX-大豆>7S-大豆。因此，7S缺失不利于TG酶對內(nèi)酯豆腐凝膠強度的提高。

圖5 不同大豆品種對酶促內(nèi)酯豆腐凝膠強度的影響
Fig.5 Effect of soybean varieties on rupture strength of lactone Tofu

由圖6可以清晰看到,TG酶作用下，7S中α’、α、γ亞基及11S中的A3肽鏈直接消失，7S中β亞基及11S中A肽鏈亦明顯減少，但11S中B肽鏈變化較之前不明顯，與之前結(jié)論一致。還原電泳圖證實酶促內(nèi)酯豆腐溶解樣中剩余大量未被交聯(lián)的含有B亞基的組分；非還原條帶可以看出酶促內(nèi)酯豆腐溶解樣中并沒有游離的B亞基，其中一小部分B以B2的形式存在，另外推斷有一部分含有B的成分是以AB的形式形成交聯(lián)的聚集體，但是B沒有直接參與交聯(lián)，當對這部分聚集體進行還原后，也可以得到B亞基和交聯(lián)的A，與相關(guān)文獻結(jié)論一致[19-20]。因此，不同大豆品種對內(nèi)酯豆腐凝膠強度及蛋白組分的SDS-PAGE分析驗證了TG酶作用機理的結(jié)論。

A-非還原電泳;B-還原電泳
圖6 不同品種大豆酶促內(nèi)酯豆腐蛋白電泳圖及蛋白組分相對含量變化
Fig.6 Effect of soybean varieties on SDS-PAGE and protein composition of lactone Tofu

3 結(jié)論

TG酶量對內(nèi)酯豆腐凝膠強度影響較大。最佳工藝為：GDL用量0.3%，TG酶用量0.05%，50 ℃保溫3 h。此時，內(nèi)酯豆腐的凝膠強度為570.5 g。

7S中的α’、α亞基及11S中的A3肽鏈與TG酶的作用關(guān)系最密切，其次是7S中β、γ亞基及11S中的A肽鏈，最后可能有關(guān)聯(lián)的是11S中的B肽鏈。氨基酸含量分析，得到α’、α、β亞基及A、B肽鏈中賴氨酸摩爾百分比分別是8.19%、9.52%、6.33%、8.07%和3.65%，即大豆蛋白中亞基或肽鏈中的賴氨酸含量與TG酶作用關(guān)系密切，賴氨酸含量越高關(guān)系越密切。實驗現(xiàn)象表明，適量TG酶可明顯改善內(nèi)酯豆腐的凝膠強度，本研究為實際生產(chǎn)中TG酶用于改善內(nèi)酯豆腐品質(zhì)提供參考。