抗生素體外及體內(nèi)抑菌效應(yīng)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)綜述報(bào)告

商飛　于魯敏　薛挺

【摘 要】本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抗生素在體外和體內(nèi)抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)闡述了其實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟以及數(shù)據(jù)處理和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)。此外，梯度稀釋法、紙片法以及稀釋涂平板等基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)操作是從事微生物科學(xué)研究的初級(jí)工作人員必須掌握的實(shí)驗(yàn)技能。

【關(guān)鍵詞】抑菌；抗生素

中圖分類號(hào)： S336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2018）06-0086-002

1 實(shí)驗(yàn)意義

本綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目作為微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充和深入，選擇抗生素為實(shí)驗(yàn)材料，主要內(nèi)容包括抗生素的體外抑菌實(shí)驗(yàn)、抗生素的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)，形成一個(gè)整體的綜合性實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上強(qiáng)調(diào)系統(tǒng)性、專業(yè)性、實(shí)用性和趣味性；涉及微生物學(xué)專業(yè)多項(xiàng)技術(shù)原理、復(fù)雜流程，將整體實(shí)驗(yàn)課程的水平從分散的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提升到綜合性、系統(tǒng)性更高的層次，對(duì)學(xué)生的動(dòng)手能力、專業(yè)水平、科研素質(zhì)等進(jìn)行全面的培養(yǎng)和提高，此即本項(xiàng)目設(shè)計(jì)的意義所在。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（1）了解常用抗菌藥物的抗菌作用及抗菌范圍，并掌握抗菌藥物的某些體外抗菌實(shí)驗(yàn)；

（2）觀察血液、細(xì)菌、藥物三者相互作用，以加深學(xué)生對(duì)抗菌藥物藥理作用的認(rèn)識(shí)；

（3）通過(guò)理論聯(lián)系實(shí)際的學(xué)習(xí)和操作訓(xùn)練，訓(xùn)練學(xué)生掌握醫(yī)學(xué)微生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)驗(yàn)技巧，提高動(dòng)手能力，有助于學(xué)生科學(xué)世界觀的形成；

（4）培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立操作、分析解決問(wèn)題的能力，提高對(duì)微生物學(xué)的興趣，為學(xué)生獨(dú)立創(chuàng)業(yè)提供一些創(chuàng)業(yè)技能思路。

3 實(shí)驗(yàn)原理

金黃色葡萄球菌是機(jī)會(huì)致病菌，而抗菌藥物在一定濃度下對(duì)其有抑制和殺滅作用?？咕幬镆话闶侵妇哂幸志驓⒕钚缘乃幬?，包括各種抗生素、磺胺類、咪唑類、硝基咪唑類、喹諾酮類等化學(xué)合成藥物。由細(xì)菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)而得到的某些產(chǎn)物，或用化學(xué)半合成法制造的相同或類似的物質(zhì)，也可化學(xué)全合成。

藥物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)，是指在體外測(cè)定藥物抑制或殺滅細(xì)菌能力的實(shí)驗(yàn)。它是常用抗菌實(shí)驗(yàn)的方法，其中最常用的方法有系列稀釋法和瓊脂擴(kuò)散法。

稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋法（斜面法）兩種，這兩種方法都可以用來(lái)測(cè)定藥物的最小抑菌濃度（MIC）：是指該藥物能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度，通常用？滋g/mL或U/mL表示。其結(jié)果判斷方法為凡無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該菌的最小抑菌濃度（MIC）。

瓊脂擴(kuò)散法是將抗菌藥物加至接種試驗(yàn)菌的平板表面，抗菌藥物在瓊脂膠內(nèi)向四周自由擴(kuò)散，其濃度隨擴(kuò)散距離增大而降低。在藥物一定的擴(kuò)散距離內(nèi)，由于藥物的抗菌效應(yīng)，試驗(yàn)菌不能生長(zhǎng)，此無(wú)菌生長(zhǎng)的范圍稱為抑菌圈。抑菌圈的大小與藥物的抑菌效應(yīng)成正比。瓊脂擴(kuò)散法常有紙片法、管碟法、打洞法和挖溝法。一般藥敏實(shí)驗(yàn)常采用紙片法，我們可以根據(jù)抑菌圈的大小，來(lái)判斷菌種對(duì)藥物的敏感性，是敏感，中度敏感還是耐藥。

藥物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)又稱為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)治療試驗(yàn)或保護(hù)力試驗(yàn)。當(dāng)抗菌藥物進(jìn)入機(jī)體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、濃汁內(nèi)的核酸均與藥物結(jié)合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機(jī)體內(nèi)的微生物代謝活動(dòng)較低，對(duì)藥物的敏感性降低，有時(shí)還可以形成細(xì)胞壁缺陷型細(xì)菌，對(duì)某些藥物不敏感。機(jī)體內(nèi)各組織中藥物的吸收、分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在評(píng)定新藥的藥效時(shí)除做體外抑菌實(shí)驗(yàn)外還需要做體內(nèi)的抗菌實(shí)驗(yàn)。

4 實(shí)驗(yàn)操作

4.1 實(shí)驗(yàn)材料與用品

材料：宿主（兔、雞等）經(jīng)抗凝處理后血液全血組分，人工培養(yǎng)的人單核巨噬細(xì)胞U937，金黃色葡萄球菌209-P（或NCTC8325）標(biāo)準(zhǔn)株。

器材：滅菌EP管（EP管），EP管架，新鮮全血，槍頭（黃、白、藍(lán)），微量移液器（10？滋L，100？滋L，1mL），滅菌小棉簽，小鑷子，圓形濾紙（直徑為6 mm），培養(yǎng)皿，紫外分光光度計(jì)，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)板。

藥品與試劑：青霉素，鏈霉素，四環(huán)素，氯霉素，紅霉素，碘酊，檸檬酸鈉，75%酒精，PBS緩沖液。

4.2 培養(yǎng)基的制備

（1）TSB+agar培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，瓊脂20.0g，溶化后分裝，121℃滅菌15min備用。

（2）TSB肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白大豆肉湯粉末30.0g，NaCl 30.0g，蒸餾水1000mL，pH 7.2，121℃滅菌15min備用。

4.3 抗菌藥物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)

4.3.1 試管法

（1）取滅菌EP管10只，按1-10編號(hào)，排列于EP管架上。無(wú)菌操作，分別加入TSB肉湯培養(yǎng)基0.5mL。用微量移液器吸取40U/mL的青霉素藥液0.5mL放入第1管，并反復(fù)吸勻。從第1管吸出0.5mL放入第2管，吸勻后吸出0.5mL放入第3管，依此法逐管進(jìn)行稀釋至第9管。第10管不加藥液作為對(duì)照管。

（2）各EP管加入0.5mL新鮮配置的稀釋濃度為10-4的金黃色葡萄球菌209-P菌液，放入孵箱內(nèi)于37℃孵育24h后取出，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并將結(jié)果記錄于表中。細(xì)菌不生長(zhǎng)的最小濃度為青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。

（3）其余抗菌藥物均按上述方法測(cè)定對(duì)金黃色葡萄球菌209-P的MIC。

4.3.2 紙片法

（1）以滅菌小棉簽蘸取金黃色葡萄球菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過(guò)多的菌液，然后輕輕地從4個(gè)不同方向平行交叉劃線，使菌液均勻涂布于整個(gè)瓊脂平板表面。

（2）取2000U/mL的青霉素、2000μg/mL的鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、2.5%的碘酊各2 mL分裝于試管中。用無(wú)菌小鑷子取圓形濾紙12張，每?jī)蓮埥谕环N藥液中，浸透后取出，瀝去過(guò)多的藥液。將2片含一種藥液的濾紙分別放在已接種細(xì)菌的瓊脂平板表面的不同區(qū)域。為了位置間隔準(zhǔn)確，最好事先在皿底用標(biāo)記筆做上記號(hào)。

（3）將培養(yǎng)皿放入孵箱內(nèi)于37℃孵育24 h，觀察紙片周圍有無(wú)抑菌圈，將結(jié)果記錄于表中。測(cè)量抑菌圈的直徑，比較各藥的抗菌效力。

4.4 抗菌藥物的體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)

4.4.1 接種法及細(xì)菌存活測(cè)試

（1）金黃色葡萄球菌各菌株劃線至TSB + agar平板上培養(yǎng)>16h；

（2）從板上挑取多個(gè)克隆到含有PBS的EP管中，離心收集菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌液濃度至吸光度OD600=0.6，稀釋100倍后取100？滋L菌液和lmL全血混合37℃搖床培養(yǎng)。

（3）分別在0h，1h，3h，5h，7h，9h時(shí)間點(diǎn)取100？滋L混合培養(yǎng)液，用無(wú)菌水稀釋10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培養(yǎng)20 h后，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌克隆數(shù)，以0 h的克隆數(shù)作為對(duì)照，計(jì)算存活率，作圖。

4.4.2 抗生素體內(nèi)治療干預(yù)實(shí)驗(yàn)

（1）依據(jù)步驟4.3.1體外抗菌實(shí)驗(yàn)的得到的各抗生素的最小抑菌濃度值，配制各種常用抗生素合適濃度的母液。

（2）金黃色葡萄球菌各菌株劃線至TSB+agar平板上培養(yǎng)>16h；

（3）從板上挑取多個(gè)克隆到含有PBS的EP管中，離心收集菌，用PBS洗滌兩遍后調(diào)菌液濃度至吸光度OD600=0.6，稀釋100倍后取100？滋L菌液和l mL全血混合，再加入工作濃度的各種抗生素，37℃搖床培養(yǎng)。

（4）分別在0h，1h，3h，5h，7h，9h時(shí)間點(diǎn)取100？滋L混合培養(yǎng)液，用無(wú)菌水稀釋10倍、100倍、1000倍涂平板，放置37℃培養(yǎng)20 h后，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)菌克隆數(shù)，以0 h的克隆數(shù)作為對(duì)照，計(jì)算存活率，作圖。

5 注意事項(xiàng)

（1）充分滅菌的槍頭和EP管應(yīng)當(dāng)烘干后使用，避免槍頭和EP管中殘余的水株對(duì)稀釋結(jié)果產(chǎn)生影響。

（2）菌液稀釋時(shí)，確保正確使用移液器，確保吸取的菌液體積正確。

（3）用移液槍吸取較為粘稠的血液時(shí)，動(dòng)作應(yīng)當(dāng)輕柔緩慢，以免血液進(jìn)入槍管，影響移液槍使用。

（4）使用滅菌小棉簽蘸取金黃色葡萄球菌液涂布瓊脂平板表面時(shí)，棉簽蘸取菌液后應(yīng)當(dāng)在EP管壁上碾壓一下，避免涂布后在平板上留下過(guò)多菌液，長(zhǎng)成較厚菌苔進(jìn)而影響后期抑菌圈觀察。

（5）菌液涂布時(shí)，應(yīng)當(dāng)在平板上均勻涂布，避免留下空白區(qū)域，影響抑菌圈大小測(cè)定。

（6）在進(jìn)行紙片法測(cè)定抑菌效果時(shí)，含有抗生素的濾紙片應(yīng)當(dāng)貼在事先劃好區(qū)域的中央，避免抑菌圈交叉對(duì)后續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)的影響。

（7）濾紙片應(yīng)當(dāng)輕輕貼附在平板表面，可用無(wú)菌的鑷子輕輕按壓，切勿造成固體瓊脂的破裂和變形，以免影響抑菌圈的大小和形狀。

（8）涂布器在涂布前應(yīng)當(dāng)使用酒精燈外焰充分灼燒，在無(wú)菌區(qū)內(nèi)晾涼后進(jìn)行涂布實(shí)驗(yàn)，避免涂布器溫度過(guò)高燙死細(xì)菌，影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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