凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定黃油中6種激素的殘留

趙超敏，古淑青，鄭江，鄧曉軍，岳振峰，賴富饒，閔甜，劉紹杰

（1.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

（2.深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

（3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（4.山東省莘縣農(nóng)業(yè)局，山東聊城 252400）

性激素是甾體激素的主要組成部分，包括雄激素、雌激素和孕激素。這些物質(zhì)具有強(qiáng)的蛋白質(zhì)同化作用，畜牧業(yè)中常被用作促生長劑，以大幅度提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益[1～5]?；趯游镌葱允称分屑に貧埩麸L(fēng)險分析的深入研究，長期攝入此類激素類藥物會導(dǎo)致消費者內(nèi)分泌紊亂和性早熟，提高致癌、致畸的風(fēng)險等[6～8]。我國農(nóng)業(yè)部明確規(guī)定，不得在動物源性食品中檢出睪酮和雌二醇[9]。睪酮、脫氫表雄酮和雄酮是主要的雄激素；雌二醇是活性最強(qiáng)的雌激素，與雌酮互為前體和代謝物；孕激素主要以孕酮為主，三類激素在代謝過程可相互轉(zhuǎn)化（圖1）。

目前關(guān)于動物源性食品中殘留激素的研究報道，主要基質(zhì)是動物肌肉組織（如豬肉、牛肉和羊肉等）、肝臟、牛奶、雞蛋和水產(chǎn)品等[10～13]，對黃油中激素殘留的分析報道還很少。黃油因其營養(yǎng)價值成為人們生活中的重要食品之一，其質(zhì)量安全關(guān)乎消費者的飲食健康。

黃油是高脂肪含量樣品，傳統(tǒng)的液液提取-固相萃取柱前處理凈化技術(shù)難以有效去除油脂共提物，因此，本研究采用去除油脂效果良好的凝膠滲透色譜（GPC）凈化技術(shù)，其根據(jù)分析物分子量大小不同而分離（色素和油脂分子量通常＞600，而激素通常＜500），可有效去除黃油中油脂和色素干擾。目前，常用的激素檢測方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）。雖然 GC/MS法與HPLC-MS/MS法相比需要衍生化，靈敏度稍低，但是GC/MS仍然是檢測類固醇激素的強(qiáng)有力工具，且在確證未知類固醇激素具有其不可替代的優(yōu)勢[14]。因此，本文采用GPC凈化技術(shù)與GC/MS相結(jié)合，同時測定黃油中6種類固醇激素，所建方法凈化效果好，回收率高和重現(xiàn)性好，滿足藥物殘留分析要求。

圖1 6種激素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure formulas of six hormones

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

6890N型氣相色譜配5975型質(zhì)譜儀（GC/MS），美國Agilent公司；全自動凝膠凈化系統(tǒng)（GPC），德國LCtech公司；漩渦振蕩器，德國Heidolph公司；往復(fù)式振蕩器，日本 Yamato公司；全自動氮吹儀，美國Caliper公司；恒溫干燥箱，德國Binder公司；低溫離心機(jī)，美國Sigma公司；移液器，法國Gilson公司。

激素標(biāo)準(zhǔn)品：睪酮（T）、雄酮（A）、脫氫表雄酮（DHEA）、孕酮（P）、雌酮（E1）、17β-雌二醇（β-E）（純度≥96.0%）均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、叔丁基甲醚和吡啶（HPLC級），購自美國TEDIA公司；乙酸酐（AR級），購自廣州化學(xué)試劑廠。

黃油樣品：市售進(jìn)口黃油。

空白樣品：選擇沒有激素檢出或含量超低水平的樣品為空白樣，用以制備驗證用加標(biāo)樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

儲備液：分別準(zhǔn)確稱取各激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 mg（精確至0.1 mg），以甲醇配制濃度為500.0 mg/L的單標(biāo)溶液，所有溶液于棕色瓶中-30 ℃儲存。

單標(biāo)工作液：現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前分別移取10.0 μL 500.0 mg/L的激素單標(biāo)溶液于2 mL樣品瓶中，40 ℃氮氣吹干甲醇溶劑，殘留物依次用100 μL乙酸酐和100 μL吡啶溶解，渦旋約1 min充分混合，于70 ℃恒溫干燥箱衍生化50 min，取出冷卻至室溫，40 ℃下氮氣吹至盡干，用環(huán)己烷定容至1 mL，供GC/MS用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前分別移取20.0 μL 500.0 mg/L的各激素單標(biāo)溶液于2 mL樣品瓶中，40 ℃氮氣吹干甲醇溶劑，殘留物依次用200 μL乙酸酐和200 μL吡啶溶解，渦旋約1 min充分混合，于70 ℃恒溫干燥箱衍生化 50 min，取出冷卻至室溫，40 ℃下氮氣吹至盡干，用環(huán)己烷定容至1 mL，并用環(huán)己烷逐級稀釋成所需濃度，供GC/MS用。

1.3 儀器參數(shù)

1.3.1 GPC條件

GPC色譜柱：40010型（300 mm×20 mm，高24 cm，24 g Bio-Beads SX-2填料）；流動相：乙酸乙酯/環(huán)己烷（1:1，V/V）；流速：4.7 mL/min；定量環(huán)：5.0 mL；紫外檢測波長：254 nm；柱預(yù)洗時間：0.17 min；前運(yùn)行時間10.67 min；主收集時間：33 min；尾洗時間：4 min；溶劑交換周期：3次。

1.3.2 GC條件

氣相色譜柱：Agilent HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；進(jìn)樣模式：不分流；前進(jìn)樣口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；MS四級桿溫度：150 ℃；輔助通道溫度：280 ℃；色譜柱流量：1 mL/min；色譜柱升溫程序：80 ℃（保持 1 min）→15 ℃/min→250 ℃（保持 2 min）→2 ℃/min→272 ℃（保持3 min）；溶劑延遲時間：5 min。

1.3.3 MS條件

電子轟擊（EI）能量：70 eV；載氣：氦氣（純度99.999%）；全掃描（Scan）質(zhì)量范圍：50～500m/z，選擇離子掃描（SIM）參數(shù)如表 1；離子駐留時間：50 ms。

表1 類固醇激素衍生物的MS采集參數(shù)Table 1 Optimized mass spectrometer parameters of steroid hormone derivatives

1.4 樣品處理

稱取1 g樣品（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入5 mL乙酸乙酯/環(huán)己烷（1:1，V/V）渦旋1 min，溶解后定容至8 mL，往復(fù)振蕩提取15 min，于10000 r/min下離心5 min，收集上清液至GPC樣品瓶中，經(jīng)GPC凈化、濃縮，收集2 mL濃縮液于收集瓶中，于40 ℃下氮氣吹至約0.5 mL，移入2 mL進(jìn)樣品中，40 ℃下氮氣吹至盡干，依次用200 μL乙酸酐和200 μL吡啶溶解殘留物，渦旋約1 min，于70 ℃恒溫干燥箱衍生化50 min，取出冷卻至室溫，40 ℃下氮氣吹至盡干，用200 μL環(huán)己烷定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供GC/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

激素是低分子量的脂溶性物質(zhì)，含量與樣品脂含量成正比[15]。

黃油是高脂含量樣品，提取效率的關(guān)鍵因素是選擇合適的提取試劑和提取方法。選擇具有脂溶性的丙酮、正己烷、乙酸乙酯、環(huán)己烷、叔丁基甲醚為提取試劑，結(jié)果顯示，雖然5種提取試劑均可以溶解黃油，但是乙酸乙酯/環(huán)己烷（1:1，V/V）溶解效果最好，溶解液為澄清溶液，同時，乙酸乙酯/環(huán)己烷也是 GPC常用流動相，因為選擇乙酸乙酯/環(huán)己烷（1:1，V/V）為提取試劑。

2.2 GPC凈化條件的確定

圖2 GPC前運(yùn)行時間（a）和主收集時間（b）對黃油中激素加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Influences of GPC-forerun time (a) and GPC-main fraction time (b) on the recovery of hormones in butter

油脂是檢測黃油中激素主要的基質(zhì)共提干擾物。GPC以多孔凝膠作為固定相，分離過程，色素和油脂等大分子物質(zhì)不易進(jìn)入凝膠顆?？變?nèi)而分布在顆粒間，首先洗脫下來，激素等小分子物質(zhì)不僅在顆粒間隙擴(kuò)散，還進(jìn)入凝膠顆粒微孔中，洗脫速度慢后流出，因此，凈化效果好。同時，流動相乙酸乙酯和環(huán)己烷沸點一致，一定比例混合后洗脫條件穩(wěn)定。

GPC凈化效果的決定因素是基質(zhì)共提干擾物與目標(biāo)分析物切割點的選擇。當(dāng)流速為4.7 mL/min時，大分子物質(zhì)油脂和色素在10 min時被洗脫去除。前運(yùn)行時間設(shè)計為10、10.17、10.33、10.5、10.67、10.83、11 min；主收集時間設(shè)計為16.7、20、25、33、42、50 min。由圖2A可知，前運(yùn)行時間為10 min時加標(biāo)回收率最高，但仍有部分油脂被接收，根據(jù)除脂效果和加標(biāo)回收率，前運(yùn)行時間為10.67 min；圖2B所示隨著主收集時間的延長加標(biāo)回收率逐漸增大，當(dāng)主收集時間延長至50 min時，加標(biāo)回收率與33 min時相差不大，為減少分析時間和節(jié)約成本，選擇主收集時間為33 min。優(yōu)化流速（4.3、4.5、4.7 mL/min）結(jié)果顯示，相近加標(biāo)回收率時，增大流速，可以大大減少樣品處理時間和減少試劑消耗，流速選擇4.7 mL/min。

2.3 衍生條件的選擇

圖3 激素的衍生化公式Fig.3 Derivatization formulas of hormones

激素具有弱揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性，含有羥基和酮基等官能團(tuán)，極性較大，沸點較高，直接用 GC/MS分析靈敏度較低，且峰型差，需要衍生化轉(zhuǎn)化為極性較低熱穩(wěn)定性好的衍生化物，以提高檢測靈敏度和改善色譜峰型。常用的衍生化法主要有硅烷化法和?；?。硅烷化法主要采用三甲基硅烷衍生化技術(shù)（TMS），同時衍生激素結(jié)構(gòu)中羥基和酮基而生成烯醇化-三甲基硅烷產(chǎn)物（如公式 1），而酰化試劑主要是酸酐類，衍生激素結(jié)構(gòu)中的羥基而生成酯類物質(zhì)（如公式 2）。TMS衍生物可能會堵塞氣相色譜柱末端或用于反吹的毛細(xì)管，?；苌飳庀嗌V毛細(xì)管柱影響小，因此，試驗選擇常用的?；噭┮宜狒痛呋噭┻拎ぷ鳛檠苌噭?/p>

通過對比不同衍生化溫度（50、60、70、80、90 ℃）和衍生化時間（20、30、40、50、60 min）時目標(biāo)分析物的峰面積，結(jié)果顯示，隨著衍生化溫度和衍生化時間的延長，目標(biāo)分析物的峰面積增加，當(dāng)70 ℃衍生化50 min時效果最好。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為確證目標(biāo)分析物的特征離子，首先采用 Scan掃描對0.5 mg/L的激素單標(biāo)衍生物進(jìn)行定性分析，根據(jù)目標(biāo)分析物的全質(zhì)譜圖，選擇干擾少、選擇性好的離子作為特征離子進(jìn)行 SIM 掃描，以相對豐度比為100的特征離子作為定量離子，另外選取2個相對豐度較高的特征離子作為定性離子，如圖4所示。

圖4 激素衍生物的Scan掃描（m/z 50～500）質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrums of hormone derivatives in full-scan mode(m/z 50～500)

2.5 色譜條件的優(yōu)化

激素衍生化物極性低，應(yīng)選擇非極性色譜柱進(jìn)行分離，HP-5MS氣相色譜柱是非極性的，且具有較低的柱流失，本實驗選擇HP-5MS為分析色譜柱。

為使目標(biāo)分析物之間和基質(zhì)共提干擾物之間獲得良好的分離度，對氣相色譜柱升溫程序進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，在氣相色譜檢測分析過程中，氣相色譜柱程序升溫速度應(yīng)＜20 ℃/min，且柱溫不能長時間在接近色譜柱最高溫度時分析，程序升溫太快或較高溫度下檢測分析，雖然大大縮短了分析時間且獲得良好分離度，但是其基線波動大，穩(wěn)定性差，并易產(chǎn)生大且無規(guī)律的干擾峰，導(dǎo)致檢測靈敏度低和重復(fù)性差。經(jīng)優(yōu)化，建立的色譜柱升溫程序為：初始溫度為80 ℃，保持1 min，以15 ℃/min速度升至250 ℃，保持2 min，以2 ℃/min速度升至272 ℃，保持3 min。色譜柱流量選擇0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，分析結(jié)果顯示在1.0 mL/min時，目標(biāo)分析物分離度好。同時，經(jīng)優(yōu)化前進(jìn)樣口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，MS四級桿溫度為150 ℃，輔助通道溫度為280 ℃時，目標(biāo)分析物靈敏度高、分離度好，色譜峰型窄而無拖尾（圖5）。

圖5 激素衍生物的SIM掃描總離子流色譜圖（TIC）（濃度：0.5 mg/L，進(jìn)樣2 μL）Fig.5 Total ion current (TIC) chromatograms of hormone derivatives in selected ion monitoring (SIM) scan mode(concentration: 0.5 mg/L, injected volume: 2 μL)

2.6 線性范圍和定量限

采用外標(biāo)法定量。回歸方程的獲得是利用濃度范圍為10～500 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/kg）和定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸計算，所得回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表 2，所得相關(guān)系數(shù)均大于0.999，線性關(guān)系良好。定量限根據(jù)信噪比S/N≥10確定，6種激素的LOQs為4～10 μg/kg。

表2 類固醇激素衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和LOQTable 2 Calibration equations, correlation coefficients and LOQ of steroid hormone derivatives

2.7 回收率與精密度

在空白樣品中添加 10 μg/kg、50 μg/kg、200 μg/kg三個濃度水平進(jìn)行回收試驗，每個水平平行測定6次，結(jié)果見表 3，回收率為 77.2～112%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2～10%，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合國內(nèi)外對激素殘留分析的要求。

表3 空白樣品中6種類固醇激素加標(biāo)的回收率和精密度（n=6）Table 3 The recoveries and accuracies of 6 steroid hormones in spiked butter (n=6)

2.8 實際樣品分析

采用所建方法對 4個市售黃油樣品進(jìn)行檢測，4個樣品均含有孕酮，其他激素未檢出，范圍為110～127 μg/kg，這與文獻(xiàn)報道的黃油中孕酮含量值（132.9±5.1 μg/kg）相接近[16]。

3 結(jié)論

本文建立了黃油中雄酮、脫氫表雄酮、睪酮、孕酮、雌酮和17β-雌二醇的氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）檢測方法。所建凝膠滲透色譜前處理技術(shù)，操作簡單、凈化效果好，大大簡化了高脂肪含量樣品的前處理過程，提高了高脂肪含量樣品中激素的提取效率，該方法準(zhǔn)確可靠，滿足高油脂樣品中激素殘留檢測要求。

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