篩選降尿酸肽的體外測定方法的建立與優(yōu)化

楊柳，康小燕，梁明，張婷，任嬌艷

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510000）

高尿酸血癥是一種嚴重威脅人類健康的代謝類疾病。治療高尿酸血癥的手段主要有：抑制尿酸的生成，促進尿酸的排泄，加速尿酸的分解。其中，抑制尿酸的生成主要通過抑制黃嘌呤氧化酶（XO）的催化活性來實現。XO是嘌呤分解代謝過程中的一種關鍵酶。在人體的新陳代謝過程中，從食物中攝取的嘌呤類物質以及體內的核酸和ATP（adenosine triphosphate）會生成次黃嘌呤，然后由黃嘌呤氧化酶作用而轉化生成尿酸[1]。因此，XO是抗高尿酸血癥藥物研究的關鍵靶點。研究表明氨基酸及多肽類物質具有良好的抑制XO的活性[2～4]，能夠有效的降低血尿酸水平。

文獻中報道了多種測定黃嘌呤氧化酶抑制活性的方法，包括紫外分光光度法[2,5～7]、NBT/PMS 顯色法[8]、雙酶偶聯法[9]、熒光分析法[8]，MTS/PMS還原法[10]，鄰二氮菲法[1]，高效液相色譜法[11～13]等。每種方法均有各自的局限性，對同一物質的檢測結果也會有較大的差異，因此亟需建立一種穩(wěn)定性精確度高的黃嘌呤氧化酶抑制活性方法。其次，對于多肽類樣品，目前報道的大多數檢測方法是直接或間接測定黃嘌呤氧化酶的催化產物尿酸的含量，檢測原理是測定 290 nm（尿酸的最大吸收波長）左右尿酸的吸收值，或者是尿酸與染料絡合得到的顯色物質的含量，然而多肽類樣品在290 nm下也具有較強的吸收，對紫外檢測會產生較大的干擾，同時部分多肽類物質具有較好的還原性易與顯色物質發(fā)生氧化還原反應，從而使檢測結果呈現假陽性或者假陰性?；赬O的另一催化產物H2O2建立的檢測方法是多肽類物質XO抑制活性檢測的較好的選擇。

本文建立了快速篩選多肽類物質對XO抑制活性的檢測方法。首先選擇雙酶偶聯法確定酶反應體系的最適條件，包括底物濃度、反應時間、酶濃度、緩沖液pH及反應溫度等，初步篩選具有降尿酸功效的多肽類物質。然后采用高效液相色譜法定量分析多肽類物質對XO的抑制活性。最后，在優(yōu)化后的酶反應條件下對比兩種方法的精密度和準確度，探討雙酶偶聯分光光度法干擾因素，確立雙酶偶聯法聯合高效液相色譜法進行多肽類物質降尿酸活性測定的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣根過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶購、黃嘌呤、別嘌呤醇（色譜純）、非布司他（色譜純）、氧化型谷胱甘肽（色譜純）、還原性谷胱甘肽（色譜純）均購于美國Sigma公司；4-氨基安替比林購于國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷購于上海伯奧生物科技有限公司；多肽由上海吉爾生化有限公司合成。其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA2104N分析天平購于上海民橋精密科學儀器有限公司；PHS-3C精密pH計購于上海儀電科學儀器股份有限公司；UV754N紫外可見分光光度計購于上海儀電分析儀器有限公司；0.22 μm PES注射器用微孔濾膜購于上海珂淮儀器有限公司；一次性2.5 mL針頭過濾器購于湖南平安醫(yī)械科技有限公司；液相色譜儀購于日本Shimadzu公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱購于美國 Agilent公司；渦旋混合儀 XW-80A購于上海精科實業(yè)有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器購于常州澳華儀器有限公司；HH-4電熱恒溫水浴鍋購于常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙酶偶聯法測定XO活性

溶液配制：1 mmol 4-氨基安替比林、12 mmol苯酚，7500 U/L HRP及50 mmol/L Tris-HCl配置顯色液。黃嘌呤用 50 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液定容至 100 mL。催化反應在50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液體系中完成。研究單因素條件下，不同底物濃度、酶濃度、溫度、pH、時間對酶活性的影響。雙酶偶聯法測定XO活性：在10 mL離心管中依次加入3150 μL顯色液，50 μL XO 酶液和 400 μL 黃嘌呤溶液，混勻，30 ℃下保溫20 min，煮沸5 min終止反應，冷卻至室溫后測定508 nm處的吸光值。以不加酶液反應體系作為參比，測定吸光值。樣品反應條件：在10 mL離心管中依次加入 100 μL 樣品，50 μL XO 酶液，混勻，30 ℃下溫浴10 min。加入400 μL黃嘌呤溶液，3050 μL顯色液啟動反應，30 ℃下溫浴20 min，煮沸5 min終止反應，待冷卻至室溫后測定508 nm處的吸光值。

1.3.2 高效液相色譜法測定尿酸含量

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL。樣品反應條件（總體積3600 μL）：10 mL離心管中依次加入100 μL樣品，50 μL XO酶液，混勻，30 ℃下溫浴10 min。加入400 μL黃嘌呤溶液，2900 μL緩沖液啟動反應，30 ℃下保溫20 min，加150 μL 1 mol/L HCl終止反應。0.22 μm PES濾膜過濾反應液后進行高相液相檢測，檢測波長為290 nm。優(yōu)化單一流動相條件如下：

流動相1：85% 15 mmol/L的NH4H2PO4+ 15%色譜級甲醇（pH 6.5）；

流動相2：90% 15 mmol/L的NH4H2PO4+ 10%色譜級甲醇（pH 6.5）；

流動相3：85% 15 mmol/L的NH4H2PO4+ 15%色譜級甲醇（pH 7.5）；

流動相4：90% 15 mmol/L的NH4H2PO4+ 10%色譜級甲醇（pH 7.5）；

流動相5：95% 15 mmol/L的NH4H2PO4+ 5%色譜級甲醇（pH 6.5）。

1.3.3 數據分析

每組實驗重復測定 3次，結果表示為平均值±標準偏差（means±SD），采用SPSS 19.0、origin 8.5軟件進行處理分析。

2 結果與討論

2.1 雙酶偶聯分光光度法測定XO活性

2.1.1 底物濃度優(yōu)化

本文選擇黃嘌呤作為黃嘌呤氧化酶的反應底物。底物濃度對酶促反應的影響如圖1所示。用酶促反應速率表示酶的催化活性。由圖1(a)可知底物黃嘌呤的濃度與酶促反應速率呈現拋物線的關系，一定范圍內，底物濃度越大，酶促反應速率越大，當底物將酶飽和時，酶促反應速率不隨底物濃度增大而增大，反應達到平衡，符合米氏方程的特點。由圖1(c)可知底物黃嘌呤的濃度倒數與酶促反應速率倒數呈線性關系，即：

圖1 黃嘌呤濃度對酶活的影響(a)、(b)雙倒數作圖(c)Fig.1 Effects of xanthine concentration on the activity of XO (a),(b) and Lineweaver-Burk plot (c)

2.1.2 反應條件優(yōu)化

在雙酶偶聯法的酶促反應體系中，底物和辣根過氧化物酶過量、反應時間一定的情況下，黃嘌呤氧化酶的濃度決定了該體系的酶促反應速率。

算得黃嘌呤氧化酶酶的Km值為0.21 mmol/L。由圖1(b)可知，黃嘌呤濃度過大會降低黃嘌呤氧化酶的活性，造成底物抑制，因此在雙酶偶聯反應體系中不宜以10Km作為反應的底物濃度，根據底物濃度選擇區(qū)間1/10 Km～10 Km，選擇本實驗的底物濃度為0.22 mmol/L。

圖2 各因素對XO酶活的影響Fig.2 Effects of various factors on the activity of XO

由圖2 (a)可知，檢測的吸光值隨酶濃度的增大而增大，當酶濃度達到0.52 u/mL時，趨勢趨于平緩，故本實驗采用0.52 u/mL作為最適酶濃度。

溫度條件的優(yōu)化結果如圖2(b)所示。隨著溫度的上升，A508值先增大后減少，符合溫度對酶促反應速率影響的一般規(guī)律，溫度較低時，酶促反應的速率隨溫度的升高而加快，超過一定范圍后，酶隨溫度的升高而失活，酶促反應速率下降。故在該反應體系下，酶的最適反應溫度為30 ℃。

pH 條件的優(yōu)化結果如圖 2(c)所示。在堿性范圍內，酶活隨pH的增大而減小。其中pH 7.5時，吸光值最大，達到0.7以上，但與其他pH的顯色液相比，其呈現淺紅色，與雙酶體系的產物顏色相近，對檢測有一定的干擾，因此本實驗選擇pH 8.0的堿性環(huán)境作為最適pH。

在此基礎上，繼續(xù)優(yōu)化反應時間，結果由圖2(d)所示，可知反應產物吸光值隨反應時間的延長而增大，25 min后其增大趨勢趨于平緩，反應達到動態(tài)平衡。最后定量描述此雙酶偶聯體系吸光值與反應時間之間關系的一級反應動力學方程，結果如圖2(e)所示：該體系線性擬合良好，較好地符合一級反應動力學規(guī)律，動力學方程為y=0.0262x-0.0240，判定系數R2=0.9961。在雙酶體系中，影響該反應速率的主要是第一步酶反應，該體系的綜合反應是準一級反應。

2.1.3 雙酶偶聯法穩(wěn)定性實驗

反應終止后，將溶液于4 ℃冰箱靜置24 h，分析檢測顯色液的穩(wěn)定性。0、24 h測定其A508值見表1。

如表1所示，0、24 h測定體系吸光值的結果相比，其差別均在標準偏差范圍內，并沒有發(fā)生明顯的變化，說明顯色體系在24 h內具有良好的穩(wěn)定性。

表1 穩(wěn)定性比較Table 1 Comparison of stability

2.2 HPLC法測定XO酶活

2.2.1 流動相優(yōu)化

選擇四種水溶性極好且抗氧化性強的多肽Glu-Cys-His、還原型谷胱甘肽（GSH）、Tyr-Glu-Cys-Gly和Tyr-Glu-Gly作為標準多肽類物質，用于優(yōu)化流動相條件。

因本實驗采用極性流動相，以上多肽的親疏水性，預測混合溶液中各物質的出峰時間先后如下：Glu-Cys-His＞GSH＞Tyr-Glu-Cys-Gly＞ 尿 酸 ＞Tyr-Glu-Gly＞黃嘌呤＞別嘌呤醇。五種流動相對單一樣品的分離效果如圖3所示。UA表示尿酸，X表示黃嘌呤。

將流動相1和流動相2，流動相3和流動相4兩兩對比發(fā)現：其他條件一定，有機相比例不同，有機相比例低的各組分出峰時間延長，但分離度提高。

圖3a中所有物質的出峰時間在5 min內，圖3b中所有物質的出峰時間在8 min內，兩種流動相條件GSH的峰與尿酸峰重疊。將流動相1和流動相3，流動相2和流動相4兩兩對比發(fā)現：其他條件一定，流動相的pH不同，Tyr-Glu-Gly的出峰時間發(fā)生改變。Tyr-Glu-Gly出峰時間位于尿酸和黃嘌呤之間。

圖3 流動相對單一樣品的分離效果Fig.3 Separation of single sample by mobile phase

圖4 不同流動相對混和樣品溶液的分離效果Fig.4 Separation effects of different mobile phases on the mixed samples

圖3a和圖3b中Tyr-Glu-Gly的峰偏向于尿酸峰（pH 6.5），而圖3c和圖3d中Tyr-Glu-Gly的峰偏向于黃嘌呤峰（pH 7.5）。兩種流動相條件 Glu-Cys-His的峰均與尿酸峰重疊。圖 3e顯示各物質出峰時間如下：Glu-Cys-His＞GSH＞尿酸＞Tyr-Glu-Gly＞黃嘌呤＞別嘌呤醇＞Tyr-Glu-Cys-Gly。出峰時間非?？拷?。

混合樣品在不同流動相的洗脫效果如圖4。圖3e和圖4結果顯示，(1)流動相5在流動相2的基礎上減少了有機相甲醇的比例（5%），延長了整體出峰時間。(2)流動相5能夠將樣品中所有的物質分離出單峰，其出峰順序如下：Glu-Cys-His＞GSH＞尿酸＞Tyr-Glu-Gly＞黃嘌呤＞別嘌呤醇＞Tyr-Glu-Cys-Gly，與預測出峰順序基本吻合。(3)尿酸和黃嘌呤的峰均是單峰，且其分離度R=13.15＞1.5，分離效果良好。

相比之下，圖4中其他4種流動相均有多肽樣品峰與尿酸峰重疊，干擾尿酸的檢測，流動相5中更適合混合樣品溶液的分離，因此選擇流動相5作為后續(xù)實驗的流動相。

2.2.2 HPLC法測定別嘌呤醇、非布司他及多肽的黃嘌呤氧化酶抑制活性

圖5 反應液峰面積曲線Fig.5 Peak area curves of reaction solution of allopurinol (a),febuxostat (b), GSH (c) and GSSG (d)

別嘌呤醇和非布司他是目前臨床上用于治療痛風和高尿酸血癥的藥物[15,16]。別嘌呤醇和非布司他能夠直接作用于黃嘌呤氧化酶的催化中心鉬蝶嶺位點，有效地抑制黃嘌呤氧化酶的活性。還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）是在實驗中被證實具有良好的抑制黃嘌呤氧化酶的活性。

由圖5結果顯示，隨著抑制劑別嘌呤醇、非布司他、GSH、Tyr-Glu-Gly濃度的增大，黃嘌呤氧化酶的產物尿酸含量不斷減少，而底物黃嘌呤的含量不斷增加，充分證實了黃嘌呤氧化酶的活性被抑制。相對于別嘌呤醇來說，非布司他對黃嘌呤氧化酶具有更強的抑制活性，實驗結果與文獻報道[17]一致，說明該液相條件對于黃嘌呤氧化酶抑制活性的檢測具有較高的準確度。GSH和GSSG同樣對黃嘌呤氧化酶存在一定的抑制活性，抑制機理有待進一步研究。

2.2.3 HPLC法與雙酶偶聯法精密度比較

本實驗通過比較同一天、同一批樣品的的相對標準偏差（RSD）來研究雙酶偶聯法和HPLC法的精密度。每個樣品選取 5～6個濃度梯度，以抑制率區(qū)間10%～100%為指標，通過預實驗確定最終樣品濃度范圍。

結果如表2所示，兩種方法測定降尿酸藥物別嘌呤醇和非布司他的抑制率時，結果無明顯差異，RSD值均在 5%以下，都具有較高的精密度，其中雙酶偶聯法的RSD值在0.40%～1.46%之間，HPLC法的RSD值在0.55%～4.72%之間，表明雙酶偶聯法測定結果的一致性更好。

對于多肽GSH和GSSG黃嘌呤氧化酶抑制活性的測定結果，兩種方法呈現較大的差異。兩種方法對于GSSG的測定結果表現出一致性，同時其RSD值均在5%以下，都具有較高的精密度。而對于GSH抑制活性的測定，雙酶法無法顯示準確的結果，分析為由于GSH[18]具有較強的自由基清除活性，雙酶偶聯法中第二步酶反應的底物H2O2被GSH清除掉，無法形成紅色絡合物，導致實驗結果不準確。

此設想經過進一步實驗驗證：直接將第一步酶反應的產物H2O2與GSH混合，再加顯色液保溫20 min，結果未形成紅色絡合物。兩種方法測定 GSH抑制活性的結果差異說明：測定具有較強自由基清除能力物質的黃嘌呤氧化酶抑制活性時雙酶偶聯法檢測失效，需要結合更有效的方法。而HPLC法檢測其抑制活性時，抑制率隨 GSH濃度的增大而升高，與別嘌呤醇和非布司他的變化規(guī)律一致，說明HPLC法對于多肽黃嘌呤氧化酶抑制活性的檢測具有一定的可信度。經多次反復實驗，HPLC法測定GSH抑制率的RSD值在0.21%～4.72%之間，具有較高的精密度。

雙酶偶聯法快速高效，可以同時測定大量的樣品，但不適于具有較強超氧自由基清除能力的多肽的測定，而HPLC法測定一個樣品需要8～15 min，測試時長，因此，在實際測定多肽類黃嘌呤氧化酶抑制活性的過程中，出于對效率和準確性的要求，需要雙酶偶聯法結合HPLC法。

表2 HPLC法與雙酶偶聯法精密度比較Table 2 Precision comparison of the HPLC method and the double-enzyme coupling method

2.2.4 HPLC法與雙酶偶聯法準確度比較

方法的準確度是指用該方法測定的結果與真實值的接近程度，一般用加標回收率表示。雙酶偶聯法加標回收率實驗設計如下：制備低、中、高濃度的黃嘌呤溶液，并測定其完全反應后的吸光值 A508，將 20μmol/L的標準H2O2加入到低、中、高濃度（40 μmol/L，120 μmol/L，200 μmol/L）的黃嘌呤溶液中，測定加標后的完全反應液的吸光值A508，每個濃度分別測定3次，計算加標回收率。HPLC法加標回收率實驗設計如下：制備低、中、高濃度（40 μmol/L，120 μmol/L，200 μmol/L）的黃嘌呤溶液，并測定其完全反應后的尿酸含量，將20 μmol/L的標準尿酸加入到低、中、高濃度的黃嘌呤溶液中，測定加標后的完全反應液的尿酸含量，每個濃度分別測定3次，計算加標回收率。

由表3可知，雙酶偶聯法和HPLC法測定低、中、高濃度底物的加標回收率均在97%以上，接近100%，說明兩種方法對于樣品的測定均具有比較高的準確性。

表3 HPLC法與雙酶偶聯法準確度比較Table 3 Accuracy comparison of the HPLC method and the double-enzyme coupling method

3 結論

3.1 本文主要建立了多肽對黃嘌呤氧化酶抑制活性的檢測方法。通過對反應體系條件優(yōu)化后，雙酶偶聯法測定黃嘌呤氧化酶抑制活性的反應條件為：黃嘌呤濃度0.22 mmol/L，酶濃度0.52 u/mL，緩沖液pH 8.0，反應溫度30 ℃，反應時間20 min。

3.2 通過優(yōu)化流動相條件后，HPLC法測定黃嘌呤氧化酶抑制活性的條件為：流動相為 95% 15 mmol/L NH4H2PO4+5%甲醇，pH 6.5，流速 1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長290 nm。雙酶偶聯法快速高效，可以同時測定大量的樣品，24 h內檢測穩(wěn)定性良好，精密度檢測RSD值低于HPLC，具有更高的精密度。但是雙酶偶聯法不適于具有較強超氧自由基清除能力的多肽的測定。而HPLC法可精確檢測較強超氧自由基清除能力的多肽抑制XO活性，但測定一個樣品需要8～15 min。

3.3 因此，在實際測定多肽類黃嘌呤氧化酶抑制活性的過程中，出于對效率和準確性的要求，建立雙酶偶聯法結合 HPLC法。本文建立了以雙酶偶聯法聯合HPLC法體外測定多肽類化合物對XO抑制活性的檢測方法，對比單酶法（常見的紫外分光光度法）等檢測方法，具有較高的準確性和精密性，為多肽類物質XO體外抑制活性的檢測提供了行之有效的檢測工具。

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