新疆巴州地區(qū)部分豬場豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測與分析

馬 博 卜三平

（巴音郭楞職業(yè)技術學院新疆庫爾勒 841000）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV)是引起豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR)的病原，PRV屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、α 皰疹病毒亞科（Alpha herpesviridae）中豬皰疹病毒Ⅰ型（Suid herpes virusⅠ）[1]。PR具有急性、熱性和高度接觸性傳染的特點，危害嚴重。豬是自然界中PRV的唯一宿主[2]，豬感染PRV后能引起腦脊髓炎癥、自身發(fā)熱、奇癢，常引起妊娠母豬流產和仔豬死亡，且仔豬死亡率偏高[3]。PR全球范圍流行，根除難度大[4]。國際獸醫(yī)局（OIE）將之列為B類動物傳染病，我國將之列為二類動物傳染病[5-6]。20世紀90年代，西方發(fā)達國家大多制定并啟動了根除PR的計劃。歐洲國家和我國均采用豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測法對豬群進行監(jiān)測，以達預防PR和凈化豬場PRV的目的[7-8]。PR于1813年最早在美國發(fā)現，1912年其被定為一種獨立的疾病。我國最早報道該病是在1947年，2011年我國大面積爆發(fā)PR，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經濟損失。我國在《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》中將PR列為優(yōu)先防治的動物疫病之一，也是種畜禽凈化的重點疫病之一，規(guī)劃中提到到2020年我國所有種豬場PR都要達到凈化標準。該病在臨床上可用血清學方法進行診斷，如ELISA、中和試驗、補體結合試驗等，因ELISA具有操作快速簡便、敏感性高、特異性強等突出優(yōu)點而被廣泛使用。

巴音郭楞蒙古自治州（簡稱巴州），為新疆維吾爾自治區(qū)下轄州，位于新疆維吾爾自治區(qū)東南部，全州在加快畜牧業(yè)的發(fā)展上做了大量工作，生豬養(yǎng)殖是巴州畜牧業(yè)發(fā)展的一個重要方向。2016—2017年期間，為調查新疆巴州地區(qū)豬群PRV野毒感染情況，本試驗從巴州地區(qū)的18個規(guī)模化豬場（庫爾勒市、輪臺縣、尉犁縣、和碩縣、若羌縣、焉耆縣、和靜縣、且末縣、博湖縣）采集血樣865份，采用間接ELISA方法檢測PRV-gE蛋白抗體情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 血樣采集

2016—2017年期間，從巴州地區(qū)的18個規(guī)?；i場（庫爾勒市、輪臺縣、尉犁縣、和碩縣、若羌縣、焉耆縣、和靜縣、且末縣、博湖縣）的不同年齡階段豬群（0～10日齡仔豬、11～20日齡仔豬、21～30日齡仔豬、后備母豬、經產母豬、種公豬）共采血樣865份。

1.1.2 試驗儀器和材料

豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒（武漢某生物公司）、移液槍、恒溫培養(yǎng)箱、自動酶標儀（美國BioTek公司）、10 mL獸用采血器、震蕩儀、計時器、燒杯、錐形瓶等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

規(guī)范地使用采血器從豬的前腔靜脈采血3～4 mL/頭，待血清析出后，將血樣放到保溫箱內（有冰袋）帶回實驗室。每份移取1 mL血清到滅菌后的EP管（1.5 mL）中，逐管標記，離心（4000 r/min，8～10 min），立即檢測或4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ㄒ蟊M快檢測）。

1.2.2 PRV-gE蛋白ELISA抗體檢測法

按照PRV-gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒使用說明書操作。室溫下，搖動濃縮洗滌液1～3 min，做20倍稀釋。1∶1分別稀釋待檢血清和對照血清。各取稀釋好的待檢血清和對照血清100 μL于包被板微孔中，陰、陽對照各設兩孔，放置于37℃恒溫箱中孵育45 min，待抗原與抗體結合后，洗滌后，加入酶標記物100 μL，37℃孵育20 min，每孔各加50 μL底物A、B，室溫避光顯色15 min，每孔再加50 μL終止液，混勻。10 min內測各反應孔中的OD630nm值，稍后根據OD630nm值判定結果。

1.2.3 判定結果的標準

使用酶標儀測OD630nm值。試驗成立的前提條件是陰性對照的OD630nm平均值與陽性對照的OD630nm平均值之差必須≥0.3。S表示各孔OD630nm值，N表示陰性對照各孔平均OD630nm值。若S/N值≤0.35，判斷gE抗體陽性；若0.4≥S/N＞0.35，判斷可疑；若S/N值＞0.4，判斷gE抗體陰性。

1.2.4 統(tǒng)計分析

使用Excel軟件統(tǒng)計分析試驗數據，計算gE抗體陽性率、可疑率、陰性率。

2 試驗結果

2.1 巴州地區(qū)豬場的PRV-gE蛋白抗體陽性率、可疑率、陰性率

豬場A、B在庫爾勒市，C、D在輪臺縣，E、F在尉犁縣，G、H在和碩縣，I、J在若羌縣，K、L在焉耆縣，M、N在和靜縣，O、P在且末縣，Q、R在博湖縣。865份血清中檢出gE抗體陽性82份，陽性率9.48%；檢出可疑血清8份，可疑率為0.92%。豬場A—R中，只有A、D、G、I、N、Q場檢測出可疑血清，可疑率分別為2.63%、4.76%、2.17%、2.13%、4.00%、1.72%，均小于10.0%。觀察豬場A—R的gE抗體陽性率，不難發(fā)現其中最大值為17.78%，最小值是2.22%，結果見表1。

統(tǒng)計巴州地區(qū)9個不同區(qū)域的18個豬場的PRV-gE蛋白抗體檢測平均陽性率發(fā)現：庫爾勒市16.79%、輪臺縣9.13%、尉犁縣8.81%、和碩縣9.79%、若羌縣7.32%、焉耆縣11.22%、和靜縣10.28%、且末縣3.44%、博湖縣9.33%。結果發(fā)現，庫爾勒市的PRV-gE蛋白抗體檢測平均陽性率最高，為16.79%；焉耆縣的僅次于庫爾勒市，為11.22%；且末縣最低，為3.44%，結果見表2。

2.2 各豬場不同年齡階段豬群的PRV-gE蛋白抗體水平

對巴州地區(qū)的18個豬場進行PRV-gE蛋白抗體檢測發(fā)現，PRV-gE蛋白抗體平均陽性率為9.48%。檢測結果發(fā)現0～10日齡仔豬、11～20日齡仔豬、21～30日齡仔豬、后備母豬、經產母豬、種公豬PRV-gE蛋白抗體陽性率分別為18.95%、9.18%、14.29%、2.52%、9.09%和6.67%；分析不同年齡階段豬群發(fā)現，后備母豬的PRV-gE蛋白抗體陽性率最低，為2.52%；陽性率最高的豬群是0～10日齡仔豬，為18.95%，結果見表3。

表1 巴州地區(qū)各豬場豬偽狂犬病病毒gE蛋白抗體ELISA檢測結果

表2 巴州地區(qū)9個不同區(qū)域豬場PRV-gE蛋白抗體分析 （%）

3 討論

3.1 巴州地區(qū)PRV-gE蛋白抗體陽性率偏低

使用PRV-gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒對采自巴州地區(qū)的865份血清進行檢測發(fā)現：有82份陽性血清，陽性率為9.48%，低于劉鴿[9]在2016年報道的北疆地區(qū)PRV-gE蛋白抗體陽性率（14.91%），低于張魯安[10]在2005年報道的新疆PRV-gE蛋白抗體陽性率（10.1%），低于胡睿銘[11]等對2011—2013年采自9個省市的692份血清樣品的PRV-gE蛋白抗體陽性率（67.05%），低于鄒敏[12]等對2012—2013年來自18個省市的393個送檢豬場共14 801份血清樣品的PRV-gE蛋白抗體陽性率（16.13%）。其中18個豬場中，有3個豬場的PRV-gE蛋白抗體陽性率高于15%，分別為15.79%、17.78%、15.22%，最低為2.22%。通過檢測結果發(fā)現，新疆巴州地區(qū)PRV-gE蛋白抗體陽性率偏低，但PRV在新疆巴州地區(qū)各豬場普遍存在。

表3 各豬場不同年齡階段豬群的PRV-gE蛋白抗體水平檢測

3.2 巴州地區(qū)的9個不同區(qū)域的PRV-gE蛋白抗體陽性率存在差異

統(tǒng)計巴州地區(qū)9個不同區(qū)域的18個豬場PRV-gE蛋白抗體檢測平均陽性率發(fā)現：庫爾勒市PRV-gE蛋白抗體檢測平均陽性率最高，為16.79%；且末縣最低，為3.44%。這說明不同區(qū)域的PRV-gE蛋白抗體陽性率存在差異，這與區(qū)域分布和各豬場的管理工作有一定關系，積極預防PR是豬場的重要工作。

3.3 不同年齡階段豬群PRV-gE蛋白抗體陽性率存在差異

統(tǒng)計分析18個豬場不同年齡階段豬群PRV-gE蛋白抗體陽性率發(fā)現：0～10日齡仔豬、11～20日齡仔豬、21～30日齡仔豬、后備母豬、經產母豬、種公豬PRV-gE蛋白抗體陽性率存在差異；其中0～10日齡仔豬PRV-gE蛋白抗體陽性率最高，后備母豬PRV-gE蛋白抗體陽性率最低。說明0～10日齡仔豬的感染率高，與母源抗體的分泌不足和血液傳播有一定關系[13]。研究發(fā)現，仔豬體內10周和13周的gE抗體可能是母源抗體[14]。

3.4 加強管理，抓好凈化豬場PR的工作

試驗結果表明，PR在新疆巴州地區(qū)普遍存在，需要加強豬場的飼養(yǎng)管理和疾病預防工作[15]，做到嚴格消毒，定期對豬群進行PRV檢測，檢測頻率通常為2次/年或者4次/年。及時發(fā)現并淘汰患PR的病豬，尤其是母豬和種公豬，因為PRV可在豬群中橫向和垂直傳播（通過公豬精液和母豬胎盤），因此，防止種豬感染PRV是防控和凈化偽狂犬病的關鍵因素之一。在加強自身豬場免疫的同時，也要防止引種傳播PRV，真正做到清內源和防外源。也可通過PRV-gE抗體定期監(jiān)測，以便了解豬群免疫狀態(tài)，查看疫苗保護效果。

3.5 使用疫苗對豬群進行科學免疫

目前，豬偽狂犬病的基因缺失苗對豬PR的免疫效果較好，可對初生仔豬進行滴鼻或者肌注免疫[16]。PR常發(fā)豬場可以進行全免，其他豬場可以進行部分免疫。免疫接種后，要及時進行PRV-gE蛋白的ELISA抗體檢測，評估豬群野毒感染情況，及時淘汰患PR的病豬和免疫耐受的豬。近幾年，PRV變異毒株出現，且處于獨立進化分支，給PR的預防工作帶來更大的困難[17-19]。并且，PRV與豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病2型（PCV2）等混合感染后，會影響免疫效果。

[1]Pomeranz LE,Reynolds AE,Hengartner CJ.Molecular biology of pseudorabies virus:Impacton neurovirology and veterinary medicine [J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2005,69(3):462-500.

[2]白文彬,于康震.動物傳染病診斷學 [M].北京:中國農業(yè)出版社,2002.

[3]殷震,劉景華.動物病毒學[M].北京:科學出版社,1997.

[4]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].北京:中國農業(yè)出版社,1980.

[5]于大海,崔硯林.中國進出境動物檢疫規(guī)范 [M].北京:中國農業(yè)出版社,1997.

[6]世界動物衛(wèi)生組織.陸生動物診斷實驗和疫苗手冊（哺乳動物、禽鳥與蜜蜂）第五版.農業(yè)部獸醫(yī)局,譯.北京:中國農業(yè)出版社,2004.

[7]Vannes A.Mathematieal modelling of Pseudorabies virus(syn.Aujeszk's disease virus) outhreaks aids eradieation programmes:a review [J].Veterinary Quarterly,2001,23(1):21-26.

[8]Pensaert M,Labarque G,Favoreel H.Aujeszky's disease vaccination and differentiation of vaccinated from infected pigs[J].Developmental Biology(Basel),2004,119:243-254.

[9]劉鴿,于會舉,張培生,等.北疆地區(qū)豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測與分析[J].養(yǎng)豬,2016,5(10):100-102.

[10]張魯安.新疆豬偽狂犬病流行病學調查及病毒株的分離鑒定[D].楊凌:西北農林科技大學,2005.

[11]胡睿銘,湯細彪,劉峰,等.2011—2013豬偽狂犬病在我國部分地區(qū)的流行病學調查與分析.第十四屆全國規(guī)?；i場主要疫病監(jiān)控與凈化專題研討會[C].武漢:華中農業(yè)大學,2013.

[12]鄒敏,楊旭兵,鄭輝,等.2012—2013年我國部分地區(qū)豬偽狂犬病流行病學調查[J].中國動物檢疫,2015(4):1-5.

[13]劉鴿,張培生,于會舉,等.北疆地區(qū)規(guī)?；i場豬瘟抗體水平檢測與分析[J].中國豬業(yè),2016(7):46-49.

[14]Van Oirschot JT,Rziha HJ,Moonen PJ,et al.Differentiation of serum antibodies from pigs vaccinated or infected with Aujeszky's disease virus by a competitive enzyme immunoassay[J].Journal of General Virology,1986,67(6):1179-1182.

[15]劉鴿,于會舉,張培生,等.熱應激對種豬繁殖性能的影響及防控措施[J].中國豬業(yè),2016(6):39-42.

[16]劉芳,薛輝,秦樹英,等.廣西豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及gE基因序列分析[J].養(yǎng)豬,2014(5):105-108.

[17]An TQ,Peng JM,Tian NZ,et al.Pseudorabies virus variant in BarthaK61 vaccinated pigs,China,2012[J].Emerging Infectious Disease,2013,19(11):1749-1755.

[18]Yu XL,Zhou Z,Hu DM,et al.Pathogenic pseudorabies virus,China,2012 [J].Emerging Infectious Disease,2014,20(1):102-104.

[19]Wu R,Bai C,Sun J,et al.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China[J].Journal of Veterinary Science,2013,14(3):363-365.