卵泡刺激素劑量依賴性表達(dá)基因的篩選

劉甜，陳曉宇，朱志偉，于福先，黃菁，賈若欣，石放雄*，潘建治,3*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210095；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，杭州310021）

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）是一種異源二聚體垂體糖蛋白，由與其他糖蛋白激素共同的α亞基和特定的β亞基組成[1]。FSH與其受體FSHR（FSH receptor）結(jié)合并激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，不僅對(duì)動(dòng)物卵泡的生長發(fā)育起決定性作用，還調(diào)控著整個(gè)母體的生殖功能。在畜牧生產(chǎn)上，F(xiàn)SH制品被廣泛用于母畜的同期發(fā)情、超數(shù)排卵、發(fā)情誘導(dǎo)及卵巢疾病治療等方面，因此，對(duì)其濃度劑量的把握顯得極其重要。目前，國內(nèi)FSH及其類似物制品即使在價(jià)格上占優(yōu)勢，但也未能完全替代進(jìn)口制品，其深層次原因在于對(duì)品質(zhì)的信賴度。除了原料來源、提煉純化工藝、批次間質(zhì)量穩(wěn)定性等問題之外，更主要的是對(duì)FSH制品的生物學(xué)效價(jià)尚缺乏精確的測定和標(biāo)注。

FSH生物活性的檢測方法主要可分為體內(nèi)檢測法和體外檢測法。最經(jīng)典的體內(nèi)檢測法是由STEELMAN等建立的以hCG增敏的雌幼大鼠卵巢增重法[2]。該方法雖然能夠較為真實(shí)地反映FSH在生物體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)，但如果供試動(dòng)物的規(guī)范性存在問題，評(píng)價(jià)的結(jié)果就會(huì)失去精確性，而且需要大量的試驗(yàn)動(dòng)物和較長的檢測時(shí)間，成本高，不便于在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)原料、中間體等實(shí)施多次檢測。此外，同一種FSH制品在不同動(dòng)物物種上的效價(jià)存在差異，從嚙齒類動(dòng)物上獲得的評(píng)價(jià)結(jié)果不一定適用于家畜。當(dāng)前，我國在養(yǎng)豬生產(chǎn)中正在積極推廣同期發(fā)情、定時(shí)輸精和批次化繁殖管理技術(shù)，F(xiàn)SH的需求量將會(huì)大幅度增加，因此，尋求其在豬上評(píng)價(jià)生物學(xué)效價(jià)的準(zhǔn)確方法變得尤為迫切。體外檢測法包括放射免疫測定法、免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附分析等，這類方法實(shí)質(zhì)是對(duì)FSH蛋白含量進(jìn)行測定，雖然能夠快速簡便地獲得測定數(shù)據(jù)，但如果FSH蛋白本身存在部分失活的情況，就不能精確地推斷出FSH制品真實(shí)的生物學(xué)活性。因此，有必要開發(fā)一種快速、簡便、精確、低成本的新檢測方法，供激素生產(chǎn)企業(yè)和用戶進(jìn)行FSH生物學(xué)效價(jià)的鑒定。

本研究運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reation,PCR）技術(shù)，分析在FSH刺激下豬卵泡顆粒細(xì)胞中基因表達(dá)的變化規(guī)律，挖掘受FSH調(diào)控、表達(dá)差異顯著的基因，最后篩選出與FSH濃度梯度呈線性相關(guān)的基因，為后續(xù)建立高效檢測FSH及其類似物制品生物活性的方法奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 卵巢顆粒細(xì)胞

本試驗(yàn)分離卵巢顆粒細(xì)胞所需的豬卵巢來自浙江省海鹽縣屠宰場，清洗卵巢周圍殘留物裝入消毒后的保溫瓶，帶回實(shí)驗(yàn)室，用注射器采集卵巢上直徑為3～6 mm卵泡的內(nèi)容物，去除卵母細(xì)胞后，收集卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

FSH購自浙江省寧波市三生藥業(yè)有限公司；透明質(zhì)酸酶（2 mg/mL）、細(xì)胞凍存液（DMSO）和胰島素購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清、1×104U/mL青霉素和1×104μg/mL鏈霉素溶液均購自美國HyClone公司；DMEM（Dulbecco’smodified eaglemedium）培養(yǎng)基、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（QuantScript RTKit）購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBRGreen Master購自瑞士Roche公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)志物（Trans2K）購自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司。轉(zhuǎn)錄組測序委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

分離的初代豬卵泡顆粒細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基、直徑10 cm培養(yǎng)皿、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，長滿后用胰酶消化傳代1～2次供用。試驗(yàn)前將細(xì)胞傳到6孔板上，待顆粒細(xì)胞長到80%以上時(shí)，將用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的FSH添加到6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成

按照Trizol法提取RNA試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，經(jīng)分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度后，保存于-70℃冰箱中備用。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（QuantScript RTKit）說明書配制含等量總RNA的反應(yīng)體系，將合成的cDNA保存于-20℃冰箱中。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序

將濃度為40 mIU/mL的FSH處理組和未處理組的細(xì)胞裂解液保存于Trizol試劑中，送往杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行測序，測序步驟簡述如下。從樣品中提取總RNA，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后，使用連接有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。經(jīng)抽提的mRNA被片段化試劑隨機(jī)打斷成短片段，以片段化的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，隨后加入緩沖液、dNTPs、核糖核酸酶（RNase）和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行二鏈cDNA合成。用AMPure XP磁珠純化雙鏈產(chǎn)物，利用T4 DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶活性將DNA的黏性末端修復(fù)為平末端，3'末端加堿基A并加接頭，用AMPure XP磁珠進(jìn)行片段選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得測序文庫，文庫質(zhì)檢合格后采用Illumina Hiseq 4000進(jìn)行測序，測序讀長為雙端2×150 bp。

1.2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選FSH顯著上調(diào)的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到相應(yīng)的基因序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，使用NCBI BLAST和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。所有引物均由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見表1。

熒光定量PCR采用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行。通過對(duì)各待測基因片段PCR反應(yīng)條件的預(yù)試優(yōu)化，確定最佳退火溫度。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，利用熒光定量PCR儀分析在擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)值的變化，并獲取各樣品、各基因的CT值，采用 2-ΔΔCT法計(jì)算推定各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 半定量PCR引物Table1 Primersused in semi-quantitative PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 在FSH刺激下差異表達(dá)基因分析

將經(jīng)40 mIU/mL FSH處理與未經(jīng)FSH處理的顆粒細(xì)胞中基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行比較，通過R語言的Ballgown包對(duì)String Tie組裝和定量完畢的基因進(jìn)行差異分析。將同時(shí)滿足以下2個(gè)條件的基因認(rèn)為是差異顯著表達(dá)的基因：1）P＜0.05；2）差異倍數(shù)≥2或者差異倍數(shù)≤0.5。根據(jù)這2個(gè)條件，我們發(fā)現(xiàn)共有47個(gè)表達(dá)差異顯著的基因，其中37個(gè)為上調(diào)基因，10個(gè)為下調(diào)基因（圖1）。在37個(gè)上調(diào)基因中，除8個(gè)新基因在NCBI上找不到基因序列外，其他上調(diào)基因如表2所示。

圖1 基因分布火山圖Fig.1 Volcano plotsof genedistribution

表2 在顆粒細(xì)胞中經(jīng)FSH處理后上調(diào)的基因Table2 Up-regulated genesin FSH-treated granulosacells

2.2 差異基因GO富集分析

基因本體（gene ontology,GO）富集分析是一個(gè)國際化標(biāo)準(zhǔn)的基因功能分類系統(tǒng)，主要用于描述生物體內(nèi)基因及其產(chǎn)物的特征。使用GO富集分析，可將基因分類到細(xì)胞因子、cAMP反應(yīng)、類固醇生物合成過程等生物過程（biological process），類固醇δ-異構(gòu)酶活性、甾體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、載脂蛋白結(jié)合等分子功能（molecular function）和各種細(xì)胞組分（cellular component）。圖2是GO功能分析所獲得的散點(diǎn)圖，圖中列出了表達(dá)量差異顯著基因參與的前20個(gè)基因功能，其中富集系數(shù)表示差異基因個(gè)數(shù)與總基因數(shù)的比值，富集系數(shù)越大，表示GO富集程度越高。從中可以看出，差異基因主要富集在參與生物過程的基因類群，尤其是類固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和合成的生物過程。

圖2 20個(gè)最顯著富集基因的GO散點(diǎn)圖Fig.2 GOtermsof 20 most significantly enriched genes

2.3 差異基因KEGG富集性分析

京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析和代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具。圖3是經(jīng)過KEGG分析獲得的富集性散點(diǎn)圖，圖中顯示了差異基因富集的前20條生物學(xué)途徑，其中富集系數(shù)表示該KEGG途徑的差異基因數(shù)與總基因數(shù)的比值，富集系數(shù)越大，P值越接近于0，基因數(shù)量最多，表明差異基因在這條途徑的富集程度越高。從中可以看出，KEGG富集程度最高的是參與卵巢類固醇合成，富集于其中的基因有IGF1、HSD3B1、STAR、SCARB1等。同時(shí)還可以看出，F(xiàn)SH可能通過部分信號(hào)通路調(diào)控顆粒細(xì)胞中的基因表達(dá)，例如FoxO信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、RIG-Ⅰ樣受體信號(hào)通路等，其中ATG12、IGF1富集于FoxO信號(hào)通路，OLR1富集于PPAR信號(hào)通路，ATG12富集于RIG-Ⅰ樣受體信號(hào)通路。

圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集性散點(diǎn)圖Fig.3 KEGGenrichment scatter plotsof differentially expressed genes

2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，并尋找表達(dá)量與FSH濃度呈依賴性上升的基因，從測序結(jié)果中選擇在FSH刺激下顯著上調(diào)并能夠在NCBI上找到基因序列的29個(gè)基因，以GAPDH為內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，29個(gè)基因的檢測結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有一致性，即FSH處理后的基因表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），表明轉(zhuǎn)錄組測序檢測到的基因表達(dá)豐度高度準(zhǔn)確。圖4列出了熒光定量PCR檢測差異倍數(shù)大于2的17個(gè)基因。

2.5 FSH劑量依賴表達(dá)基因的篩選分析

為了找出表達(dá)量與FSH濃度梯度呈高度線性相關(guān)的基因，對(duì)17個(gè)熒光定量PCR檢測表達(dá)量呈2倍以上差異的基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。首先，用等量增加的不同濃度 FSH（0、20、40、60、80、100 mIU/mL）處理顆粒細(xì)胞，經(jīng)相同時(shí)間后，收集細(xì)胞進(jìn)行RNA提取和熒光定量PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在FSH的刺激下，雖然所有基因的表達(dá)均比空白對(duì)照有所上升，但變化趨勢并不一致。部分基因例如STAR、AMCF-Ⅱ的表達(dá)量雖然隨著FSH濃度的增加有升高的趨勢，但缺乏線性相關(guān)關(guān)系；另一些基因例如ENDOD1、C1QTNF3的表達(dá)量在較低FSH濃度時(shí)有明顯相關(guān)性，但100 mIU/mL處理組的表達(dá)量反而低于80 mIU/mL處理組，表明這些基因表達(dá)與FSH濃度梯度相關(guān)的范圍較狹窄。最終，我們選擇了表達(dá)量與FSH濃度有明顯依存關(guān)系的LHCGR、S100A12、SCARA5和OLR1這4個(gè)候補(bǔ)基因，進(jìn)行后續(xù)FSH濃度依賴表達(dá)試驗(yàn)。

圖4 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)結(jié)果Fig.4 Resultsof geneexpressionsdetected by real-timefluorescent quantitative PCR

用等倍增長的不同濃度FSH（0、1、3、9、27、81、243、729 mIU/mL）處理顆粒細(xì)胞，刺激18 h后收集樣品，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測LHCGR、S100A12、SCARA5和OLR1基因表達(dá)的變化情況（圖5）。從中可以發(fā)現(xiàn)：在FSH的刺激下，S100A12、SCARA5和OLR1基因雖然總體上呈上升趨勢，但在低濃度時(shí)反應(yīng)不明顯，在較高濃度時(shí)隨FSH濃度變化的線性關(guān)系不強(qiáng)；而LHCGR基因在0～243 mIU/mL FSH濃度范圍內(nèi)的表達(dá)量與FSH濃度存在極強(qiáng)的線性相關(guān)性，只有當(dāng)FSH濃度達(dá)到729 mIU/mL時(shí)，才出現(xiàn)了小幅度的逆轉(zhuǎn)。

圖5 不同濃度FSH處理顆粒細(xì)胞后的基因表達(dá)情況Fig.5 Expression of genes in granulosa cells cultured with FSH of various concentrations

2.6 LHCGR基因表達(dá)量與FSH濃度的相關(guān)性分析

在0、1、3、9、27、81、243 mIU/mL FSH的濃度梯度下，3次重復(fù)測定了LHCGR基因的表達(dá)量，均獲得與圖5一致的結(jié)果，表明在0～243 mIU/mL FSH濃度范圍內(nèi)，LHCGR基因表達(dá)量高度依賴于FSH濃度。代表性試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。將FSH濃度作為自變量，LHCGR基因表達(dá)量作為因變量，進(jìn)行回歸分析，獲得了y=0.189 4x-0.120 7的回歸方程，兩者決定系數(shù)R2達(dá)到0.982，接近于1，且各濃度之間差異顯著。這說明LHCGR的表達(dá)量與FSH濃度呈極強(qiáng)的線性相關(guān)關(guān)系。

圖6 LHCGR基因表達(dá)量與FSH濃度的線性關(guān)系Fig.6 Linear relationship between the expression of LHCGR gene and FSH concentration

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量技術(shù)對(duì)RNA分子進(jìn)行大規(guī)模的研究，主要是檢查細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的豐度和構(gòu)成[3-4]。轉(zhuǎn)錄組測序可以通過捕獲定量表達(dá)模式來檢測基因活性和調(diào)節(jié)的變化，并且能夠非常詳細(xì)地描述基礎(chǔ)表型，還可以提供關(guān)于結(jié)構(gòu)、修飾[5]和轉(zhuǎn)錄物的變化細(xì)節(jié)[6-7]，通過檢測得到的大規(guī)模數(shù)據(jù)方便理解細(xì)胞中基因表達(dá)的變化情況[8]。在本研究中，我們運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得了大量受FSH調(diào)控的基因，結(jié)果顯示：在卵泡顆粒細(xì)胞中受FSH調(diào)控的基因共有15 776個(gè)，其中上調(diào)的有9 111個(gè)；分析差異表達(dá)基因結(jié)果，最終在顆粒細(xì)胞中受FSH顯著上調(diào)的基因僅有37個(gè)。通過GO功能富集分析，這些基因主要參與了細(xì)胞過程和分子功能相關(guān)生物活動(dòng)，包括類固醇生物合成相關(guān)過程、對(duì)cAMP反應(yīng)、對(duì)脂多糖反應(yīng)、糖蛋白生物合成過程等。結(jié)合KEGG富集性分析，這些顯著上調(diào)基因參與富集性較高的信號(hào)通路主要有FoxO信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路和RIG-Ⅰ樣受體信號(hào)通路。這些結(jié)果可為進(jìn)一步進(jìn)行FSH調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的分子生物學(xué)研究提供參考依據(jù)。

有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH受體活化后通過上調(diào)500個(gè)左右目標(biāo)基因的表達(dá)來促進(jìn)卵泡成熟[9]，其中促黃體素/促性腺激素受體（LHCGR）被認(rèn)為是FSH誘導(dǎo)下重要的靶基因之一[10]，同時(shí)，LHCGR也是生殖功能調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體，與類固醇激素代謝和卵巢卵泡發(fā)育密切相關(guān)。有研究顯示，質(zhì)量濃度僅為30 ng/mL的FSH就能夠顯著提高LHCGR的表達(dá)量，同時(shí)隨著處理時(shí)間的延長表達(dá)量增加，在72 h達(dá)到平臺(tái)期[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在豬卵泡顆粒細(xì)胞中LHCGR的表達(dá)量在FSH處理前后差異顯著，而且，隨著FSH濃度的上升而逐步增加，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果具有一致性。本試驗(yàn)還明確了在FSH刺激后18 h，LHCGR表達(dá)量與FSH濃度呈線性相關(guān)的范圍為0～243 mIU/mL，這為后續(xù)建立可靠的FSH制品效價(jià)檢測新方法奠定了基礎(chǔ)。

當(dāng)然，要建立標(biāo)準(zhǔn)化的FSH制品效價(jià)檢測技術(shù)體系，還需要進(jìn)一步的研究探索。其一，本試驗(yàn)采用6孔板做FSH濃度梯度試驗(yàn)，經(jīng)RNA提取與反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR測定，需要耗時(shí)1周左右，同時(shí)一次性檢測的樣本數(shù)量少，需要進(jìn)一步簡化、優(yōu)化，特別是要建立將細(xì)胞FSH刺激、細(xì)胞裂解、RNA提取、cDNA合成和定量PCR檢測在96孔板內(nèi)完成的高通量、快速的檢測操作模式；其二，利用FSH標(biāo)準(zhǔn)品，通過與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢測法（大鼠卵巢增重法）的同步檢測比較，以明確這2種方法檢測結(jié)果的異同和優(yōu)劣點(diǎn)；其三，孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）也是糖蛋白類激素的一種，其β亞基的肽序列具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，兼有LH和FSH這2種激素的功能，能夠與FSH和LH的受體結(jié)合發(fā)揮其生理作用，且PMSG因其半衰期長、只需一次性注射和價(jià)格便宜等優(yōu)勢，較FSH在畜牧生產(chǎn)上應(yīng)用更為廣泛[13-14]，因此，有必要確認(rèn)FSH的效價(jià)檢測方法是否同樣適用于PMSG；其四，通過比較豬卵泡顆粒細(xì)胞分離的豬卵泡發(fā)育階段和傳代培養(yǎng)代次的差異，亟待篩選出具有更好檢測靈敏度和穩(wěn)定性的檢測用細(xì)胞。此外，從屠宰場獲取豬卵巢分離顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，容易受到細(xì)胞來源的限制，如果能夠獲得一種激素反應(yīng)性穩(wěn)定的永生化豬卵泡顆粒細(xì)胞系用于檢測，將更為便利和規(guī)范。目前，永生化卵泡顆粒細(xì)胞系有多種，包括來源于鼠[15]、牛[16]、豬[17-21]和人[22-23]等的顆粒細(xì)胞系，屬于永生化豬顆粒細(xì)胞系的有PGV、PGC-2、JC-410和ACG-16等。其中：PGV細(xì)胞系由病毒感染小卵泡中的顆粒細(xì)胞而來，對(duì)FSH刺激有反應(yīng)，但沒有類固醇生成活性[17]；PGC-2細(xì)胞系和JC-410細(xì)胞系都是在繼代培養(yǎng)過程中自發(fā)獲得永生性[18-20]，但這2種細(xì)胞系不含有FSH受體，失去了對(duì)促性腺激素的反應(yīng)性；AVG-16細(xì)胞系由中等豬卵泡顆粒細(xì)胞建立，也對(duì)FSH刺激沒有反應(yīng)[21]。這說明卵泡顆粒細(xì)胞系在永生化過程中會(huì)發(fā)生促性腺激素受體喪失的情況。因此，將克隆的豬FSHR導(dǎo)入至永生化豬細(xì)胞，獲取豬FSHR穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，使之成為檢測FSH和PMSG在豬上的生物學(xué)效價(jià)的細(xì)胞工具，可能是一條可行的途徑。

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